JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medizin

Bir Yenidoğan Fare Omurilik Sıkıştırma Yaralanması Modeli

Published: March 27, 2016
doi:
10.3791/53498
, ,
1Department of Neurosurgery,Oslo University Hospital, 2Norwegian Center for Stem Cell Research,Oslo University Hospital, 3Laboratory of Neural Development and Optical Recording (NDEVOR), Department of Physiology, Institute of Basic Medical Sciences,University of Oslo

Summary

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Abstract

Spinal kord yaralanması (SKY), tipik olarak, özellikle omurilik beyinden inen liflerin zarar yoluyla, yıkıcı nörolojik defisit neden olur. Araştırmanın önemli bir akım alan SKY aşağıdaki spontan veya uyarılmış fonksiyonel iyileşmeyi altında yatan adaptif plastisite mekanizmaları üzerine odaklanmıştır. Spontan fonksiyonel iyileşme omurilik geliştikçe nasıl adaptif plastisite değişiklikleri ile ilgili ilginç sorular yükselterek, hayatta daha erken olduğu bildirilmiştir. Bu dinamiğin soruşturma kolaylaştırmak için, yenidoğan fare bir SCI modeli geliştirdik. Model çok az çalışılan pediatrik SCI için önemi vardır. Yetişkin nöral plastisite yaşamın erken 1 nöral plastisite ile aynı mekanizmaların bazıları içerir çünkü bu model potansiyel yetişkin SCI için de bazı alaka olabilir. Burada yenidoğan fare tekrarlanabilir omurilik basısı (SCC) yaralanma üretmek için tüm prosedürü tariferken doğum sonrası (P) gün olarak 1. SCC verilen omurga düzeyde bir laminektomi yapılarak elde edilir hızla sıkıştırmak ve omurilik genişletmek için bir modifiye Yaşargil anevrizma mini klip kullanarak ve sonra (burada göğüs düzeylerde 9-11 açıklanan) . Daha önce açıklandığı gibi, yaralı yenidoğan fareler davranışsal açıkları için test ya da elektrofizyolojik ve yüksek verimli optik kayıt teknikleri 1 kullanılarak sinaptik bağlantı ex vivo fizyolojik analiz için feda edilebilir. Davranışsal ve fizyolojik değerlendirme kullanarak erken ve sürekli çalışmalar 2 hafta içinde tam bir fonksiyonel iyileşme ardından hindlimb motilite dramatik, akut bozulma ve sinaptik bağlantıları 1 inerek belirlenen düzeyinde işlevsel devresi değişikliklerin ilk kanıtları ortaya koymuştur.

Introduction

During the last decade, increasing evidence obtained from different spinal cord injury (SCI) models has shown that spinal networks can reorganize spontaneously to contribute to functional recovery1-9. Adaptive plasticity has as a consequence become an important topic in SCI research. It has been shown that plasticity encompasses regrowth of spared axons, sprouting of new axon collaterals and the formation of novel synaptic connections. Much of this knowledge has been obtained from behavioral or anatomical studies in adult animals. An important limitation of adult spinal cord studies is the difficulty of performing high-throughput physiological assessment, which is easier in neonatal preparations1. One major difference is that wholemount ex vivo preparations of the adult brainstem and spinal cord have low viability. Another is that adult spinal tissue is more opaque to light because it is thicker and myelinated. Although recent advances in in vivo imaging (see for example, 10-12) may partially overcome these problems, the possibility of performing high throughput imaging at any desired dorsoventral depth at multiple sites along a given brainstem-spinal cord preparation is currently only feasible in neonates. The immature state of axon myelination in the neonatal spinal cord facilitates high-throughput ex vivo optical recording, thus permitting a dynamic assessment of functional synaptic connections13-17. Combined with genetically encoded calcium reporters and optogenetic stimulation and pharmacology tools, optical approaches can contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying adaptive plasticity.

It is estimated that between 1-10% of all spinal cord injuries affect infants and children18-22. In contrast to adult SCI the pathogenesis and potential for spontaneous recovery in pediatric SCI is less studied. Using a neonatal SCI model can therefore provide more insight into pediatric SCI and contribute to a better understanding of the pathogenetic and recovery mechanisms involved. Moreover, post-SCI plasticity supporting functional recovery in the adult spinal cord is believed to involve at least in part the same mechanisms that govern the development of the central nervous system such as axon growth, branching and formation of new synapses23-26. Thus, using a neonatal SCI model could provide important insights into mechanisms that are also operative in the adult spinal cord, or that could potentially be reinstated in the adult spinal cord (for example by implantation of fetal cells or tissue or of tissue constructed de novo from pluripotent stem cells) to facilitate recovery.

The neonatal mouse thus provides a platform for an integrative, multi-methodological approach to investigating adaptive plasticity following spinal cord injury, in which a combination of behavioral, physiological, anatomical, molecular and genetic methods can be readily employed. Establishing standardized neonatal injury models is an important step in implementing such studies.

Protocol

Bu deneysel protokol Ulusal Hayvan Araştırmaları Norveç'te Kurum tarafından onaylanan (Forsøksdyrutvalget, yerel deneysel onay numarası 12,4591) Avrupa Birliği hayvan bakım yönetmeliklerine uygun (Federasyon Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Derneği). Çabalar kullanılan hayvanların ve onların acıları sayısını en aza indirmek için yapılmıştır. Bu yazıda, doğum sonrası (P) Gün 1 vahşi tür ICR (Basma kontrol bölgesi) farelerden (The Jackson, ABD) kullanılan prosedür açıklanmıştır, ancak, aynı yaklaşım, daha sonraki aşamada kullanılabilir. 1. Yenidoğan Farelerde için gaz Anestezi Sistemi Oluşturma (Şekil 1) Bir şırınga ucundan bir burun maskesi oluşturun. Plastik boru (- kırmızı boru ve Şekil 2A1 Şekil 1) ile 3-yollu bu bağlayın. burun maskesi tarafında küçük bir delik delin ve gaz taşması kaldırmak için plastik boru için bu bağlantımaske. Boru ya hafif bir negatif basınç için ayarlanabilir bir vakum pompası ya da bir davlumbaz (- parlak yeşil boru Şekil 1) sona. 150 mm x 25 mm plastik Petri kabı (Şekil 2A2) bir anestezi bölmesi sağlayın. Bir tarafta, fare baş ve burun maskesi karşılamak için yeterince büyük bir delik açın. Karşı tarafta, ve burun maskesi plastik tüpler eklenebilir hangi aracılığıyla iki küçük delik (- sırasıyla kırmızı ve parlak yeşil boru, Şekil 1). Kapağın üzerine üçüncü bir delik açın ve bu vakum pompası (Şekil 1 – koyu yeşil boru) biter üçüncü plastik tüp takın. Bu üçüncü tüp amacı burun maskesi çıkışına tarafından yakalanan olmamıştır herhangi bir aşırı gaz söktürücü olduğundan emin olmaktır. C kadar büyük olduğu laboratuar çanak herhangi bir alt bir delik ile, bir uyku odası oluşturmakFare ontain ve pürüzsüz ve hatta kenarı vardır (yemeğin açılış gazının sızmasını önlemek için tablo ile aynı hizada yalan gerekir). Plastik boru (- kahverengi boru Şekil 1) ile 3-yollu odanın delik bağlayın. davlumbaz altında uyku odasına yerleştirin. Buharlaştırıcı (- sarı boru ve Şekil 2A3 Şekil 1) den çıkış tüpüne bir 3-yollu stopcock takın. Oksijen kaynağı (- mavi boru Şekil 1) buharlaştırıcı girişini bağlayın. Sıkıştırma Aracı oluşturma Bir Yaşargil Geçici Anevrizma Mini klibin 2. modifikasyonu (Şekil 2 ve Tablo 1) bir kelepçe ile bir stand sıkıca klibi yapıştırın. Bir bileme taş kullanılarak yaklaşık 150 um'lik bir son kalınlık kazanmaları için, her klip kanadının ucuna dış yüzeyinden aşağı dosya görsel kontrol için binoküler büyüteç kullanılarak bir matkap (Şekil 2B ve C) üzerine monte edilir. </li> Bir mikro-bıçak (Tablo 1) kullanarak bir stereomikroskop altında polietilen kılcal boru (Tablo 1) kısa bir esneme keserek klibi için bir stoper yapın ve bıçaklar biri bu koyun (Şekil 2A4 ve 2B ve C Rakamlar). Bu klibin tam kapanmasını önler ve standart sıkıştırma boyutlarını oluşturur. klip kapatıldığında interblade mesafe yaklaşık 230 mm. interblade alanı değiştirecek kullanım sırasında sıkıştırmak olabilir polietilen malzemeden, her bir deney için yeni bir stoper yapın. Not: Klibin yay gerginliği zamanla azalır yaklaşık 80 kompresyon sonra klip artık stoper tam kapanır ve değiştirilmesi gerektiğini böyle. Cerrahi 3. Hazırlık önce (Şekil 2A5 uyku odasının (Şekil 1) fare yerleştirin ve% 4 izofluran ile anestezi başlatmak </strong>), Bir buharlaştırıcı (Şekil 2A3 ve Tablo 1) kullanarak, saf oksijen buharlaşmış. yavaşça ince plastik forseps ile ayak parmakları arasında cilt web sıkıştırarak fare çekilme refleksi test edin. yeni doğan farelerin kolayca yaralı olarak dikkatli bir şekilde yapın. Hemen morarma çok zor sonuçlara kısma. sedasyon başında bu testi gerçekleştirme refleksini tetikler ve gerekli kuvvet miktarının iyi bir gösterge sağlar. Refleks kaldırılmıştır sonra, uyku odasından fareyi kaldırmak ve saf oksijen (Şekil 1) karışık% 4 izofluran sürekli kaynağı sağlar burun maskesi takılı burnu ile ameliyat masasına yüzükoyun pozisyonda yerleştirin. ısınma pad ölümcül olabilir ameliyat sırasında hipotermi olarak 37-38 ° C'ye açık ve ayarlanmış olduğundan emin olun. Tam analjezi elde edilmesi için, (deri altından lokal anestezik Bupivakain 50 ul enjekte 2.5 mg / ml, <strong> cerrahi yerinde Şekil 2A6) 9-T11) (Burada bildirilen deneylerde, bu torasik seviyede (T altındadır). Enjeksiyon yapmak için (300 ul, 30 g, Şekil 2A7 ve Tablo 1) bir insülin şırınga kullanın. % 1-2 burun maskesi teslim izofluran konsantrasyonunu azaltmak. 4. Dorsal laminektomi mikroskopik kontrol altında ameliyat. En az 30 saniye süreyle klorheksidin glukonat (Tablo 1 # 19) ile cerrahi bölgeyi temizledikten sonra, bir microknife (Şekil 2A8) ile T9-T11 de 1-2 mm enine cilt kesi yapmak. Not: ICR yenidoğan farelerde mide rostral parçası, o sütü içeren görünür olduğunda, omurga seviyeleri T12-T13 (Şekil 3) karşı karşıya. Başka bir dönüm noktası T8-9 hakkında biter göğüs cilt altı yağ dokusu agrega rostral parçasıdır. Bu dönüm noktası cilt insizyonu sonra görülür. <li> forseps (Şekil 2A9 A10) (pürüzsüz ve düz bir yara oluşturmak, deri kolay yırtılan) yavaşça rostral ve kaudal cilt çekerek 8-9 mm enine bir doğrultuda cilt açıklığından genişletmek için. Bu omuriliğe yeterli yanal erişim sağlar. Hemostatik jelatin sünger steril parçalarını kesi (Şekil 2A11 ve Tablo 1) deri altından rostral ve kaudal takarak yatan yapılardan cilt kesisi kenarlarını geri çekin. Bu açılış büyütür ve geri çekilmeden ve ameliyat sırasında bölgeyi obscuring cildi önler. hemostatik jelatin sünger kullanımdan önce serum fizyolojik batırılmış gerek yoktur. Omurga ortaya çıkarmak için, ince makas (Şekil 2A12 ve Tablo 1) kullanılarak paravertebral kasları teşrih. Vertebral kolon kasların ekleri kesin ve lamina (Şekil 4A) maruz kalmaktadır. değile de bu aşamada spinal süreç az gelişmiştir. Orta hattı belirlemek ve ince makas (Şekil 4B) ile (bu aşamada kıkırdaklı olan) iki lamina arasındaki enine kesti. Dikkatle lamina ve dura (Şekil 4C) arasında ince bir forseps bir bıçak yerleştirin forseps ile lamina kavramak ve bir parça sağlam dura (Şekil 4D) bırakarak, uzak kırar kadar dikkatlice kaldırın. 1-2 segmenti uzun laminektomi elde etmek için bu 2-3 kez tekrarlayın. rongeurs ince forseps kullanarak, vertebral kanal içinde klibi yerleştirmek için yeterli alan kazanmak için bilateral faset eklemlerin parçalarını kaldırmak. Cerrahi alanını temizlemek ve hemostatik jelatin sünger küçük parçalar ile kanama kontrol eder. 5. Omurilik Sıkıştırma Yaralanması Klip tutucu değiştirilmiş anevrizma mini klip açın (Şekil 2A13 ve Şekil 2B) ve yer incifaset katılır arasındaki boşluklar ve kordon omuriliğin iki tarafında e bıçaklar. Bıçaklar omuriliğin ventral bölümünü etkileyecek yeterince derin takılı olduğundan emin olun. Bu mümkün değilse, faset eklemlerin daha fazla çıkarın. kaymasını önlemek için klip tutucu ile yerde tutarak, hızla mini klip bırakın. 15 sn sıkıştırma koruyun. Hızla mini klip açın ve çıkarın. önce (ikinci 15 sn sıkıştırma ters yönde klibi yeniden konumlandırmak, mini klip yönünü tersine, bir kılavuz olarak birinci sıkıştırma hemorajik ödem tarafından yapılan kolayca görülebilir işareti kullanarak, bir simetrik sıkıştırma elde etmek için tek kompresyon değil 1 yapmak ise deney), bu simetrik histolojik ve fizyolojik açıkları üretir olduğunu göstermiştir. Dura sıkıştırma zarar olmamalıdır. bölgeyi temizleyin ve hemostatik jelatin sünger parçaları ile hemostaz sürdürmek. Ameliyat başlangıcında cilt kesi kenarlarında altına alınmıştır hemostatik jelatin sünger parçaları çıkarın ve steril 6.0 sütür ve bir iğne tutucu (Şekil 2A14 ve 15) ile cilt kesisi kapatın. deri altından enjekte 0.75 mg / kg vücut ağırlığı buprenorfin bir insülin şırıngası (300 ul, 30 g) kullanılarak, steril PBS içinde seyreltilmiş (Şekil 2A16). 6. Ameliyat Sonrası Bakım burun maskesi fareyi çıkarın ve anestezi kapalı giyer ve fare (1-3 saat tipik yeterlidir) uyarı hale gelinceye kadar 30 ° C'de sıcaklık kontrollü bir odacık sette yerleştirin. Intraperitonal anne (8 g / kg vücut ağırlığı) Diazepam (Şekil 2B17) enjekte edilir. Bu, bu riski en yüksek olduğu, ilk gece boyunca yamyamlık riskini ortadan kaldırır bir hissizlik yaratıyor. çöp opere fare dönün. çöp l isearge (> 12 yavru), süt için rekabeti azaltmak için ameliyat edilmemiş yavruların bazı boyut olarak farklı ise tercihen daha büyük hayvanlar, kaldırın. çöp boyutu yaklaşık 9 yavrular ise ameliyat yavruların anne bakımı ICR doğrultusunda en iyisidir. ağrı tedavisi için, bir insülin şırınga (300 ul, 30 G) kullanılarak, postoperatif ilk günlerinde Buprenorfin (0.75 mg / kg vücut ağırlığı) subkütan günde bir kez uygulayın. deri altına enjeksiyon için uygun bir birim 30-50 ml. Yenidoğan fareler ses çıkarma ve ajitasyon ağrı iyi göstergeleridir. beslenme, vücut ağırlığı, dehidratasyon, ağrı, yara iyileşmesi, idrar tutma ve enfeksiyon durumunu değerlendirmek için bir puan sayfasını kullanarak yaralı farelerin günlük muayene gerçekleştirin. Elde edilen skora göre, anormal beslenme halinde steril pediyatrik beslenme solüsyonu (Tablo 1 # 18) enjeksiyonu gibi, özel bir dikkat sağlar. Ayrıca skor levha0; insani uç nokta kriterlerini tanımlar. yaralı yavrular reddetmek değil bir anne iyi bakıcı olduğunu. fonksiyonu sağlanana kadar mesane disfonksiyonu olağandışı bir durumda, günde iki kez mesane masaj uygulayın. Bu, bir yandan bir yatar pozisyonda fare yerleştirerek ve parmak kullanarak postero-kaudal yönde hafifçe alt karın masaj yapılır.

Representative Results

Omurilik yaralanması sıkıştırma ve fonksiyon kaybı Ameliyat öncesi, ameliyat ve ameliyat sonrası işlemleri iyileştirmek suretiyle, daha önce tarif edildiği gibi, yeni doğan fare tekrarlanabilir bir sıkıştırma SCI MODEL 1 elde edilebilir. Klibin (Şekil 2B ve C) bir bıçak yerleştirilen polietilen durdurucu klibin tam kapanmasını önler ve yaklaşık 230 mikron sürekli bıçak-arası mesafe tutar. Histolojik sekel ile değerlendirildiği gibi, simetrik bir yaralanma iki kompresyon sonuçları arasında klip yönünü Geri (Şekil 5A ve 1). Hemen mini klip çıkarılmasından sonra, sıkıştırılmış omurilik dokusu hemorajik kontüzyon ve ödem nedeniyle koyulaşır. Eozin ve Hematoksilen zaten bir gün için lekeli yaralı omurilik seri bölümlerinin Gözlemlezyon merkez üssü (Şekil 5A) yaklaşırken Frangoulis yaralanma dokusu yavaş yavaş bozulma ortaya koymaktadır. lezyonda İntraspinal boşlukların varlığı veya kan alışılmadık bir durum değildir. Davranış değerlendirme, ameliyat sonrası açısı olmayan koşullar ağırlığı altında birkaç saat arka bacak yörüngeleri izleyerek, örneğin, sadece laminektomi gerçekleştirildiği sham kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında, SCC yaralanmış farelere arka bacak motilite dramatik bir bozulma gösterir (Şekil 5B ve 1) . Fare kendi ağırlığını 1 taşıyan gerektiren diğer davranışsal testler mümkün olana kadar bu test tekrarlanabilir. Ameliyat sonrası mortalite ve kurtarma İntraoperatif mortalite apne ve yeterli anesthesi elde etmek için gerekli izofluran yüksek konsantrasyonda kaynaklanan kardiyak arrest kaynaklanmaktadıra. Cerrahi protokole lokal anestezik bupivakainin Tanıtımı izofluran konsantrasyonu azalmaya izin verir ve böylece önemli ölçüde ölüm oranı azalır. 20'den fazla hayvanlar da dahil olmak üzere son deneysel seride, intraoperatif ölüm nil. Buna karşılık, post-operatif yaşam ağırlıklı anneleri tarafından işletilen farelerin kabul etkilenir. Önemli bir gelişme, kaygı ve saldırganlık çöp 1 ile işletilen fareler dönmeden önce anne Diazepam (IP 8 g / kg vücut ağırlığı) tek bir enjeksiyon sağlayarak indirgenmiş de meydana gelmiştir. ameliyat farelerin kabulü ve ameliyat sonrası iyileşme midede süt varlığı ile izlenebilir. Sarhoş süt var P1-P7 fare mide karın derisi (Şekil 3) ile açıkça beyaz ve görülebilir. ameliyat, sahte kontrol ve ameliyat edilmemiş farelerde beslenme karşılaştırılması injure beslenme durumunun değerlendirilmesi için yararlıdırd fareler. Opere farelere karşı işletilen büyümesini değerlendirilmesi (Şekil 6) ilk post-operatif gün boyunca küçük bir kilo kaybına rağmen, ameliyat farelerin büyüme eğrisi hızla sonra normale olduğunu göstermektedir. mesane disfonksiyonu veya enfeksiyon ile ilişkili mortalite sürece 7 olarak hafta boyunca çalışılan farelerde bile hiç gözlenmemiş. Şekil l'de sayısı. 2 isim İmalatçı / Sağlayıcı Referans # Bağlantı Yorum 1 Plastik şırınga (30 ya da 50 mi) 2 Plastik Petri kabı (150 x 25 mm) 3 Fortec izofluran buharlaştırıcı Cyprane http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ Biz kullanmak ve üretim dışında eski cihaz, yeni cihaz için linki kontrol 4a Yaşargil geçici anevrizma mini klip Aesculap FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf 4b İnce delik polietilen kılcal boru kimliği 0.58 mm OD 0.96 mm Smiths Medical 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/ 5 Izofluran (Forene) Abbott GmbH & Co. http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html 6 Marcain (Bupivakain) AstraZeneca http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine 7 Insülin şırınga 0.3 ml 30 G x 8mm VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138 8 Ultra İnce Mikro Bıçağı 5 mm kesme kenarı Güzel Bilim Araçları 10.315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat ve suchkatalog = 0019900000 ve reloadmenu = 1 9 Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm İpucu Güzel Bilim Araçları 1153-1110 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat ve suchkatalog = 0055700000 ve reloadmenu = 1 gerçekten gerekli değil, sık sık dişleri çok büyük <td> 10 Forseps Supergrip Düz Güzel Bilim Araçları 00.632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat ve suchkatalog = 0053500000 ve reloadmenu = 1 İki forseps gereklidir 11 Spongostan Özel 70 x 50 x 1 mm Ferrosan 12 Vannas Bahar Makas – 2 mm Bıçaklar Düz Güzel Bilim Araçları 15.000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat ve suchkatalog = 0012800000 ve reloadmenu = 1 13 Vario Klip uygulama Forseps Aesculap FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf 14 Vicryl 6-0 (Ethicon) Johnson & Johnson J105G 15 Diethrich mikro iğne tutucu 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html 16 Temgesic (Buprenorfin) Schering-Plough 17 Stesolid (diazepam) Actavis Ayrıca Valium şekilde bilinmektedir 18 Pedamix Fresenius Kabi http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ernring/parenteral-ernring 19 Klorhexidinsprit (klorheksidin glukonat) Fresenius Kabi D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639 Yenidoğan fare bir klip odaklı omurilik sıkıştırma yaralanma üretmek için alet ve ekipman Tablo 1. listesi. Anestezi kurulum Şekil 1. Şematik. Bu şematik ilk anestezi ve cerrahi sırasında sürekli anestezi için bir burun maskesi aygıtı için bir uyku odası ile neonatal fare için tasarlanmış anestezi kurulum, sunar. Şekil 2. Temel araçları ve sıkıştırma klibi. (A) işlem sırasında kullanılan araçlar. Sayılar Tablo 1'de. (B ve C) manuel olarak yaklaşık 150 mikron kalınlığında aşağı kesilmiş her bıçağın ucu ile bir Yaşargil geçici anevrizma mini klip kullanılan açıklama karşılık gelmektedir. Polietilen boru (Tablo 1), bir dilim yapılmış bir durdurucu klibin tam kapanmaması için bıçakların biri üzerine yerleştirilir. Ölçek çubuğu: 2 mm. Uygulama: klip aplikatör (A # 12); St:. Tıpa bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Yenidoğan ICR fare spinal seviyede preoperatif değerlendirme için Şekil 3. Landmark. (A) s beyaz süt ile P1 ICR fare Yanal görünümü tomach. Midenin rostral kısmı T12-T13 spinal seviyeye gelir. (B) yüzükoyun pozisyonda anestezi altında P1 ICR fare. (A) 'da daha görselleştirmek için daha zor olmasına rağmen, süt dolu mide tanınabilir. Midenin rostral kısmı T12-T13 spinal seviyesini gösterir. Ölçek çubukları: 0.5 cm. Paravertebral kasların Şekil 4. dorsal laminektomi. (A) Diseksiyon. Bu yaşta omurilik süreç gelişmemiş olduğunu unutmayın. İnce makas ile lamina (B) Enine kesit. Lamina ve dura arasında ince forseps bir kanadın (C) giriş. giriş noktası ok ile gösterilir. (D) lamina çıkarılması. Ölçek çubuğu: 2 mm. dosyaları / ftp_upload / 53498 / 53498fig5.jpg "/> Şekil 5. histolojik ve P1 spinal kord kompresyon yaralanması sonrasında davranışsal sonuçları. (A) hasar merkezinden farklı mesafede (yaralanma sonrası 1 gün) yaralı bir fare omurilik bölümlerde Eozin ve Hematoksilen boyama. (B) ön ayakları ve hindlimb yörüngeleri Temsilcisi izleri yaralanma sonrasında veya sahte kontrol laminektomi 6 saat sonra gözlemledik. üst izleri bir hayvan yan görünümden inceledi yörüngeleri temsil etmektedir. altındaki izleri hayvanın ventral açıdan bakıldığında yörüngeleri temsil etmektedir. Ayrıca 1 Bkz. Ölçek çubuğu: 250 mikron. DH: dorsal boynuz; L, sol; R: right; SCC: omurilik basısı; VH:. Ventral boynuz bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt = "Şekil 6" src = "/ files / ftp_upload / 53498 / 53498fig6.jpg" /> Doğum sonrası güne 9 doğum sonrası gün 1 ameliyat edilmemiş ve SCC yaralı farelerin kilo alımını gösteren Şekil 6. Karşılaştırmalı büyüme eğrileri. Histogram.

Discussion

Bu yazıda P1 farelerde bir klip oluşturulan SCC yaralanma prosedürleri tarif edilmektedir. Aynı prosedürler, daha sonraki aşamalarda gerçekleştirilebilir. Sıkıştırma yaralanması P5, P7, P9 ve P12 (Züchner, et al., Hazırlama yazısı) başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Tüm doğum sonrası aşamalarında, genel anestezi saf oksijen buharlaşmış izofluran ile elde edilir, ancak anestezi sonuç yaş büyük ölçüde bağlıdır. Lokal anestezi protokolü girmiştir önce P1-P4 başlangıç ​​girişimleri, yetersiz sedasyon ve aşırı doz arasındaki dar doz-etki penceresine derin ve uzun süreli sedasyon elde etmek zordu. Buna ek olarak, yeni doğmuş hayvanlarda izofluran bir nörotoksik etkisi ile ilgili endişeler 27-30 ortaya atılmıştır. izofluran bir arada ve daha derin ve daha istikrarlı anestezi lokal anestezik Bupivakain sonuçları 2-3 faktöründe bir izofluran doz azaltılması izin verirken. anestezi Farklı türlerisia 31,32 cryoanesthesia dahil olmak üzere, yeni doğan kemirgenler için tarif edilmiştir, ama cryoanesthesia potansiyel bir rahatsızlık etkili ve yeniden üretilebilir bir yaralanma nesil karmaşık hale getirebilir (33,34 tarafından incelenmiştir) kendi nöro-koruyucu bir etkisi vardır. Barbiturat bazlı anestezi sayesinde yetişkin 35,36 göre serum albümin ve vücut yağının düşük seviyelere neonatal farelerde daha düşük verim sahip olduğu kabul edilir.

Oldukça invaziv ve travmatik olsa prosedür ameliyat sırasında ölüm oranını kurulduktan sonra, düşüktür. Ancak, ameliyat farelerin kurtarma ve hayatta kalma geliştirmek için özellikle dikkat gerektiren işlem sırasında kritik adımlar vardır. Bir önemli konu ameliyatı hayatta kalmak için en iyi şansına sahip olacak yavrular seçmektir. çöp büyük olduğunda bireysel yavruların beslenme durumu değişir. Ameliyat sırasında meydana kaçınılmaz kanama ek olarak, ameliyat yavrular saat harcamakuzak anneden s ve genellikle ertesi sabah önce süt içmeyin. Nedenle daha önce, mide süt belirli bir miktarda yavrular seçmek için bir avantajdır. Bu P0 dan P7 karın deri yoluyla kolayca görülebilir.

ilk gece boyunca çalışan yavru anne tarafından cannibalized olma büyük bir risk altındadır. daha ameliyat farelerin yarısından bu modelin ilk gelişimi sırasında kafes içinde kan açık işaretleri ile, ertesi sabah eksik. Kemirgenlerde Necrophagy, yamyamlık ve infanticide yıllardır 37-40 için çalışılmıştır. Bu çalışmada, yamyamlık sadece bir kez tanık oldu, ama kafes iade edildi yavrular gece boyunca doğal nedenlerle ölüm imkansız gibi görünen böyle iyi durumda genellikle çünkü necrophagy daha muhtemel bir açıklama olarak kabul edildi. Bu kaygı ve saldırganlık i azaltmak için böyle Diazepam gibi geri dönüşümlü farmakolojik ajan kullanma fikrini istenirn (41 tarafından gözden) annesi. Diazepam intraperitoneal ölçüde daha az% 20 fazla% 60 ilk gece boyunca mortalite bırakarak, durumu düzeldi.

Ameliyat sonrası geri dönüş aşağıdaki itlaf ve mümkün olduğunca çöp kadar az bozarak çöp boyutunu küçültme ameliyat hayvanlar yararlanabilir ek unsurlardır. Ancak, anne ile sadece çalışan yavrular bırakarak yararlı değildir. / Çalıştırılan ameliyat edilmemiş yavruların en iyi denge hattına göre değişir, ama 3-4 ameliyat edilmemiş yavrular ile birlikte 4-5 çalıştırılan yavrular (yaralanma veya sahte) bırakarak ICR ve SCID-ICR farelerinde için en iyi sonuçları verdi olabilir.

Genel anlamda, bu yenidoğan SCI modelinin ana sınırlama yenidoğan omurilik yetişkin SCI modellerden elde edilen karşılaştırılabilir deney sonuçlarını temin edemeyebilir ve böylece yetişkin omurilikten birçok açıdan farklıdır ve olmasıdır. Bu farklılıklar genel boyutunu içerir veomurilik hacmi, hücre sayısı, az temsil gibi oligodendrositler olgunlaşmamış bağışıklık tepkilerinin ve olgun olmayan nöronal devreler gibi özel hücre tiplerinin. Bu modelde deneylerden elde edilen sonuçları dikkatlice düşünülmelidir. Öte yandan, model, pediyatrik MSY nispeten daha az araştırılmıştır senaryo için de geçerlidir. Ayrıca, yetişkin SCI modellerle ilgili belirgin zayıflığı yeniden eğer yetişkin omurilik minimal kaybolmamış olsa, terapötik alt tabakayı temsil edebilecek, plastisite mekanizmalarının aydınlatılmasını izin verebileceği potansiyel gücü de. Yenidoğan ya da embriyonik koşullarının eski haline az gelişmiş hücre veya doku implantasyon yoluyla veya daha önceki gelişim özellikleri erişkin doku doğurmak tepkin maddeler ile muamele ile uygulanabilir olduğu düşünülebilir. Perinöronal ağları ortadan kaldırmak için enzimler kullanarak ikinci bir yaklaşım 42,43 örneğidir.

<p class="Jove_content"> SCI için bir hayvan modeli oluşturmak önemli bir konu standardize yaralanma elde etmektir. Bu, birden çok SCI modellerinde ele alınmıştır, örneğin, transseksiyon, hemiseksiyona, Kırıcılar, cihazları etkileyen açısından vs balon sıkıştırma, forseps ezmek, statik ağırlık sıkıştırma, bu yönde çabalar SCI modellerinde sonuçlandı önemli bir yönüdür (44 tarafından gözden) hız, kuvvet ve süre gibi darbe birden fazla parametre manipüle edilebilir yetişkin kemirgenler. Başka bir yaklaşım, daha az ekipman içeren, Kerr-Lougheed anevrizma klibi 45,46 bir değişiklik kullanır. çarpma klip taklit eşzamanlı iskemi bazı derecesine sahip bir sıkıştırma yaralanma oysa bir kafa travması taklit Bunlar 2 yaklaşımlar tamamlayıcı niteliktedir. Çünkü önemli boyutu kısıtlamaları ve yenidoğan farelerin daha açığına, yüksek mortalite uzun ameliyatlar yanı sıra devel maliyetleri ile ilişkilidaha küçük ölçekli ekipman oping, bir çarpma oluşturulan çürük yaklaşımı yerine bir klip oluşturulan sıkıştırma geliştirmek için seçildi. Bu yenidoğan farelerin 1 vertebral kolonun boyutuna uyması için piyasada mevcut olan anevrizma mini klip uyarlayarak gerçekleştirildi. Bir stoper ekleme standart sıkıştırma genişliği sağlar ve sürece klibin gerginlik stoper sınırına kadar sıkıştırır olarak, asgari genişliği statik aşamasında sıkıştırma kuvveti biraz farklı olmalıdır. Bu kullanım ömrü boyunca klip Gerilim değişimleri değişir çünkü ne standart değil, dinamik aşamasında sıkıştırma hızıdır. sıkıştırma statik faz dinamik faz daha uzun sürer ve omurilik dokusu mini klip bıçağa karşı bir karşı çok uygular önermek için orada küçük olduğu için yaralanmanın şiddeti en fazla bağımlı olması muhtemeldir statik faz. Bununla birlikte, bu test edilmesi gerekmektedir. hasarşiddeti statik sıkıştırma kuvveti ve süresi, sıkıştırma ve dekompresyon hızı, mini klip pozisyon ve aynı sitede yapılan kompresyon sayısı dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır muhtemeldir. Bu nedenle, bu parametreleri kombinasyon varyasyonu zayıftan ciddi yaralanma şiddeti bir spektrum oluşumu gerçekleşebilir. Değişkenliği potansiyeline rağmen, bizim daha önce yayınlanmış bir çalışmada 1 biz histolojik, fizyolojik ve davranışsal düzeyde tutarlı sonuçlar elde yüzden kabul edilebilir standardizasyon elde etmek zor olduğunu önermek az şey vardır. Biz çalışmamızda Şekil 5'te gösterildiği gibi hava-adımlama gibi davranışsal testler de dahil olmak üzere, her düzeyde doğrulama birden fazla yöntem kullanılır unutmayın.

Bu yenidoğan SCI modelinde yaralanma akson belli bir oranda yedek parça ve böylece yeniden modelin yoluyla adaptif plastisite ortaya çıkarmak için elverişli bir durum sağlarbağışladı bağlantıların g ve yeni devrelerin oluşumu. yenidoğan fare de birçok deneysel yöntemlerle soruşturma için uygundur Üstelik, davranış testleri, retrograd ve anterograd aksonal izleme, immünhistokimya, elektrofizyoloji ve yüksek olmak üzere entegre bir yaklaşımla fonksiyonel iyileşmeyi ve adaptif plastisite, incelemek için bu modeli kullanmak mümkündür -throughput optik kayıt 1. Bir örnek olarak, biz ex vivo Wholemount beyin sapı hazırlıkları ve yaralı omurilik 1 yüksek verimli kalsiyum görüntüleme kullanarak belirli inen girişlerinin seviyesinde ağ yeniden modelleme göstermek için bu bütünleştirici yaklaşımın yararlandı. Bu spinal nöronlar belirli alt popülasyonlar arasında sinaptik bağlantıların biçimlenme değerlendirmek için nöro-optogenetic ve optogenetic farmakoloji araçlarını kullanarak daha itilebilir.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work has been supported by grants from the South-Eastern Norway Regional Health Authority (JLB, 2014119; JCG, project numbers 2015045 and 2012065), by the Norwegian Research Council (JCG, project number 23 00 00) and the University of Oslo.

Materials

Plastic seringe (30 or 50 mL)
Plastic petri dish (150x25mm)
Fortec isoflurane vaporizer Cyprane We use and old device out of production, check the link for newer device
Yasargil temporary aneurysm mini-clip Æsculap FE681K
Fine -Bore Polyethylene tubing ID 0.58mm, OD 0.96mm Smiths Medical 800/100/200
Isoflurane (Forene) Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacain) AstraZeneca
Insuline seringe 0.3ml 30Gx8mm VWR 80086-442
Ultra Fine Micro Knife 5mm cutting edge Fine Science Tools 10315-12
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5mm Tip Fine Science Tools 1153-10 Not really necessary, often the teeth are too large
Forceps SuperGrip Straight Fine Science Tools 00632-11 Two forceps are necessary
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
Vannas Spring Scissors – 2mm Blades Straight Fine Science Tools 15000-03
Vario Clip Applying Forceps Aesculap FE502T
Vicryl 6–0 (Ethicon) Johnson and Johnson J105G
Diethrich micro needle holder 11-510-20
Temgesic (buprenorphine) Schering-Plough
Stesolid (diazepam) Actavis Also known as Valium
Pedamix Fresenius Kabi
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) Fresenius Kabi D08A C02
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Boulland, J. -. L., Lambert, F. M., Züchner, M., Strom, S., Glover, J. C. A Neonatal Mouse Spinal Cord Injury Model for Assessing Post-Injury Adaptive Plasticity and Human Stem Cell Integration. PLoS ONE. 8 (8), (2013).
  2. Raineteau, O., Schwab, M. E. Plasticity of motor systems after incomplete spinal cord injury. Nat. Rev. Neurosci. 2 (4), 263-273 (2001).
  3. Edgerton, V. R., Tillakaratne, N. J. K., Bigbee, A. J., de Leon, R. D., Roy, R. R. Plasticity of the spinal neural circuitry after injury. Annu. Rev. Neurosci. 27, 145-167 (2004).
  4. Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat. Neurosci. 7 (3), 269-277 (2004).
  5. Cai, L. L., et al. Plasticity of functional connectivity in the adult spinal cord. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B., Biol. Sci. 361 (1473), 1635-1646 (2006).
  6. Courtine, G., Song, B., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).
  7. Courtine, G., et al. Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input. Nat. Neurosci. 12 (10), 1333-1342 (2009).
  8. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Axons with highly branched terminal regions successfully regenerate across spinal midline transections in the adult cat. J. Comp. Neurol. 519 (16), 3240-3258 (2011).
  9. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Spinal interneuron axons spontaneously regenerate after spinal cord injury in the adult feline. J. Neurosci. 29 (39), 12145-12158 (2009).
  10. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  11. Oshima, Y., et al. Intravital multiphoton fluorescence imaging and optical manipulation of spinal cord in mice, using a compact fiber laser system. Lasers Surg. Med. 46 (7), 563-572 (2014).
  12. Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9 (8), e104250 (2014).
  13. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. 588 (Pt 24), 4905-4925 (2010).
  14. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Vestibular-mediated synaptic inputs and pathways to sympathetic preganglionic neurons in the neonatal mouse. J. Physiol. 590 (Pt 22), 5809-5826 (2012).
  15. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Differential origin of reticulospinal drive to motoneurons innervating trunk and hindlimb muscles in the mouse revealed by optical recording. J. Physiol. 586 (Pt 21), 5259-5276 (2008).
  16. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31 (12), 4731-4742 (2011).
  17. Szokol, K., Perreault, M. -. C. Imaging synaptically mediated responses produced by brainstem inputs onto identified spinal neurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. Meth. 180 (1), 1-8 (2009).
  18. Pang, D. Spinal cord injury without radiographic abnormality in children, 2 decades later. Neurosurgery. 55 (6), 1325-1342 (2004).
  19. Lee, J. H., Sung, I. Y., Kang, J. Y., Park, S. R. Characteristics of pediatric-onset spinal cord injury. Pediatr. Int. 51 (2), 254-257 (2009).
  20. Parent, S., Mac-Thiong, J. -. M., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: a systematic review of the literature. J. Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
  21. Basu, S. Spinal injuries in children. Front Neurol. 3, 96 (2012).
  22. Chien, L. -. C., et al. Age, sex, and socio-economic status affect the incidence of pediatric spinal cord injury: an eleven-year national cohort study. PloS One. 7 (6), e39264 (2012).
  23. Maier, I. C., Schwab, M. E. Sprouting, regeneration and circuit formation in the injured spinal cord: factors and activity. Philos. T. R. Soc. Lond. B. 361 (1473), 1611-1634 (2006).
  24. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr. Opin. Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  25. Jakeman, L. B., Hoschouer, E. L., Basso, D. M. Injured mice at the gym: review, results and considerations for combining chondroitinase and locomotor exercise to enhance recovery after spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84 (4-5), 317-326 (2011).
  26. Rhodes, K., Fawcett, J. Chondroitin sulphate proteoglycans: preventing plasticity or protecting the CNS?. J. Anat. 204 (1), 33-48 (2004).
  27. Zhu, C., et al. Isoflurane anesthesia induced persistent, progressive memory impairment, caused a loss of neural stem cells, and reduced neurogenesis in young, but not adult, rodents. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30 (5), 1017-1030 (2010).
  28. Loepke, A. W., et al. The effects of neonatal isoflurane exposure in mice on brain cell viability, adult behavior, learning, and memory. Anesth. Analg. 108 (1), 90-104 (2009).
  29. Rothstein, S., Simkins, T., Nunez, J. L. Response to neonatal anesthesia – effect of sex on anatomical and behavioral outcome. Neurowissenschaften. 152 (4), 959-969 (2008).
  30. Rizzi, S., Carter, L. B., Ori, C., Jevtovic-Todorovic, V. Clinical anesthesia causes permanent damage to the fetal guinea pig brain. Brain Pathol. 18 (2), (2008).
  31. Janus, C., Golde, T. The effect of brief neonatal cryoanesthesia on physical development and adult cognitive function in mice. Behav. Brain Res. 259, 253-260 (2014).
  32. Nuñez, J. L., Koss, W. A., Juraska, J. M. Hippocampal anatomy and water maze performance are affected by neonatal cryoanesthesia in rats of both sexes. Horm. Behav. 37 (3), 169-178 (2000).
  33. Batchelor, P. E., et al. Systematic review and meta-analysis of therapeutic hypothermia in animal models of spinal cord injury. PloS one. 8 (8), e71317 (2013).
  34. Kwon, B. K., et al. Hypothermia for spinal cord injury. The Spine Journal. 8 (6), 859-874 (2008).
  35. Benjamin, M. M. . Outline of veterinary clinical pathology. , (1978).
  36. Cunningham, M. G., McKay, R. D. G. A hypothermic miniaturized stereotaxic instrument for surgery in newborn rats. J. Neurosci. Methods. 47 (1-2), 105-114 (1993).
  37. Lane-Petter, W. Cannibalism in rats and mice. Proc. R. Soc. Med. 61 (12), 1295-1296 (1968).
  38. Gandelman, R., Simon, N. G. Spontaneous pup-killing by mice in response to large litters. Dev. Psychobiol. 11 (3), 235-241 (1978).
  39. Taylor, G. T. Urinary odors and size protect juvenile laboratory mice from adult male attack. Dev. Psychobiol. 15 (2), 171-186 (1982).
  40. Weber, E. M., Algers, B., Hultgren, J., Olsson, I. A. Pup mortality in laboratory mice — infanticide or not?. Acta Vet Scand. 55 (1), 83 (2013).
  41. Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci. Biobehav. Rev. 9 (1), 37-44 (1985).
  42. Kwok, J. C. F., Heller, J. P., Zhao, R. -. R., Fawcett, J. W. Targeting inhibitory chondroitin sulphate proteoglycans to promote plasticity after injury. Methods Mol. Biol. 1162, 127-138 (2014).
  43. Kwok, J. C. F., Afshari, F., Garcìa-Alìas, G., Fawcett, J. W. Proteoglycans in the central nervous system: plasticity, regeneration and their stimulation with chondroitinase ABC. Restor. Neurol. Neurosci. 26 (2-3), 131-145 (2008).
  44. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog. Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  45. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J. Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
  46. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute cord injury model in the rat. Surg. Neurol. 10 (1), 38-43 (1978).
  47. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 1. Clip design, behavioral outcomes, and histopathology. J. Neurotrauma. 19 (2), 175-190 (2002).
  48. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 2. Quantitative neuroanatomical assessment and analysis of the relationships between axonal tracts, residual tissue, and locomotor recovery. J. Neurotrauma. 19 (2), 191-203 (2002).

Tags

Neonatal MouseSpinal Cord CompressionInjury ModelLaminectomyYasargil Temporary Aneurysm MiniclipCompression InjurySurgical ProcedureAnesthesiaAnalgesiaAdaptive Plasticity

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Züchner, M., Glover, J. C., Boulland, J. A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model. J. Vis. Exp. (109), e53498, doi:10.3791/53498 (2016).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image