A Neonatal do rato Spinal Cord Injury Compression Modelo

Este protocolo experimental foi aprovado pela Autoridade Nacional de Pesquisa Animal da Noruega (Forsøksdyrutvalget, número local experimental aprovação 12,4591) em conformidade com os regulamentos da União Europeia de cuidados de animais (Associação Ciência Animal Federação Laboratório Europeu). Foram feitos esforços para minimizar o número de animais utilizados e seu sofrimento. Neste artigo, o procedimento utilizado em pós-natal (P) dia 1 de tipo selvagem ICR (imprinting Região de Controle) ratinhos (Jackson, EUA) é descrito mas a mesma abordagem pode também ser utilizado em fases posteriores. 1. Construção de um sistema de anestesia de gás para ratos Neonatal (Figura 1) Construir um nariz-máscara a partir da ponta de uma seringa. Conecte-o ao 3-way válvula com tubo de plástico (Figura 1 – tubo vermelho e Figura 2A1). Perfurar um pequeno furo no lado da máscara nariz e ligar esta para tubos de plástico para remover o excesso de gás a partir damáscara. Terminar a tubagem, quer a uma bomba de vácuo ajustado para uma pressão ligeiramente negativa, ou numa hotte (Figura 1 – tubo verde-claro). Realizar uma câmara de anestesia de um x 25 mm de plástico de Petri 150 mm (Figura 2A2). De um lado, fazer um buraco grande o suficiente para acomodar a cabeça do rato ea máscara nariz. No lado oposto, faça dois furos menores por meio do qual os tubos de plástico de e para a máscara do nariz podem ser inseridos (figura 1 – tubulação vermelho e verde brilhante, respectivamente). Adicione um terceiro orifício na parte superior da tampa e se ligar a este um terceiro tubo de plástico que termina na bomba de vácuo (Figura 1 – tubo verde-escuro). O objectivo deste terceiro tubo é para assegurar que qualquer excesso de gás, que não foi captada pela saída do nariz máscara é removida. Criar uma câmara de sono, fazendo um buraco no fundo de qualquer tipo de prato de laboratório que é suficientemente grande para Contain o rato e tem uma borda lisa e uniforme (na abertura do prato deve estar nivelada com a tabela para evitar fugas de gás). Ligue o orifício na câmara até a torneira de 3 vias com tubo de plástico (Figura 1 – tubo castanho). Coloque a câmara de dormir sob uma coifa. Conectar uma torneira de passagem de 3 vias para o tubo de saída do vaporizador (Figura 1 – tubo amarelo e Figura 2A3). Ligue a entrada do vaporizador para o fornecimento de oxigénio (Figura 1 – tubo azul). 2. A modificação de um Yasargil temporária Aneurysm Mini-clip para criar a ferramenta de compressão (Figura 2 e Tabela 1) Apor o clipe firmemente a um carrinho com uma braçadeira. Usando uma lupa binocular para controle visual, arquivo para baixo da superfície exterior da ponta de cada lâmina de clipe para uma espessura final de cerca de 150 um, utilizando uma pedra de afiar montado sobre uma broca (Figura 2B e C). </li> Adicione uma rolha para o clipe por corte de um curto troço de tubo de polietileno capilar (Tabela 1) sob um estereomicroscópio usando um micro-faca (Tabela 1), e colocar este em uma das lâminas (Figura 2A4 e as Figuras 2B e C). Isso impede o fechamento completo do clipe e cria dimensões compressão padronizados. Quando o clipe estiver fechou a distância interblade é de cerca de 230 um. Fazer uma nova rolha para cada experiência como o material de polietileno pode comprimir durante a sua utilização, o que alteraria o espaço interblade. Nota: A tensão da mola de aperto diminui ao longo do tempo tais que, após cerca de 80 compressões o clipe não fecha totalmente a rolha e necessita de ser substituída. 3. Preparação antes da cirurgia Colocar o rato na câmara de sono (Figura 1) e iniciar a anestesia com isoflurano a 4% (Figura 2A5 </strong>) Vaporizado em oxigénio puro, usando um vaporizador (Figura 2A3 e Tabela 1). Teste o reflexo de retirada do mouse por beliscar suavemente a web de pele entre os dedos dos pés com uma fina pinça de plástico. Faça isso com cuidado como ratos recém-nascidos são facilmente feridos. Beliscar resultados muito duras em hematomas imediata. Se efectuar este ensaio, no início da sedação desencadeia o reflexo e fornece uma boa indicação da quantidade de força necessária. Uma vez que o reflexo é abolido, remova o mouse da câmara de sono e colocá-lo em uma posição propensa na mesa de operação com o focinho inserido no nariz máscara que proporciona um fornecimento contínuo de 4% de isoflurano misturado com oxigênio puro (Figura 1). Certifique-se de que a almofada de aquecimento está ligado e definido para 37-38 ° C como hipotermia durante a cirurgia pode ser fatal. Para obter analgesia completa, injectar por via subcutânea de 50 uL de anestésico local bupivacaína (2,5 mg / ml, <strong> Figura 2A6) no local da cirurgia (nas experiências relatadas aqui, isto é ao nível torácico (T) 9-T11). Usar uma seringa de insulina (300 ul, 30 g, Figura 2A7 e Tabela 1) para executar a injecção. Reduzir a concentração de isoflurano entregue ao nariz máscara para 1-2%. 4. Dorsal Laminectomy Realizar a cirurgia sob controle microscópico. Depois de limpar a área de cirurgia com gluconato de clorexidina (Tabela 1 # 19) durante pelo menos 30 segundos, fazer um 1-2 mm incisão cutânea transversal em T9-T11 usando um microlanceta (Figura 2A8). Nota: Em ratinhos ICR neonatal a porção rostral do estômago, visível quando contém leite, está de frente para os níveis vertebrais T12-T13 (Figura 3). Outro marco é a parte rostral do agregado tecido adiposo subcutâneo torácica que termina em cerca de T8-9. Este marco é visível somente após incisão na pele. <li> utilize uma pinça (Figura 2A9 e A10) para aumentar a abertura da pele numa direcção transversal para 8-9 mm, puxando a pele suavemente rostral e caudal (a pele rasga facilmente, criando uma ferida suave e linear). Isto proporciona acesso lateral suficiente para a coluna vertebral. Retrair as bordas da incisão da pele a partir de estruturas subjacentes através da inserção de peças estéreis de esponja de gelatina hemostática (Figura 2A11 e Tabela 1) por via subcutânea rostral e caudal para a incisão. Isto aumenta a abertura e impede a pele de retracção e obscurecendo a área durante a cirurgia. A esponja de gelatina hemostática não necessita de ser embebido em solução salina, antes da utilização. Para expor a coluna vertebral, dissecar os músculos paravertebrais, usando tesouras finas (Figura 2A12, e Tabela 1). Corte os anexos dos músculos para a coluna vertebral e expor a lâmina (Figura 4A). Nãoe também que, nesta fase do processo espinhal é subdesenvolvido. Identificar a linha média e cortar transversalmente entre as duas lâminas (que, nesta fase, é cartilaginoso) com tesouras finas (Figura 4B). Coloque cuidadosamente uma lâmina de uma fina fórceps entre a lâmina e a dura-máter (Figura 4C), segure a lâmina com a pinça e levante-o cuidadosamente até um pedaço quebra, deixando a dura-máter intacta (Figura 4D). Repita este procedimento 2-3 vezes para obter um longo laminectomia 1-2 segmento. Usando fórceps finos como fórceps, remover partes das articulações bilateralmente para ganhar espaço suficiente para colocar o clipe dentro do canal vertebral. Limpar a área cirúrgica e controlar o sangramento com pequenos pedaços de esponja de gelatina hemostática. 5. Spinal Cord Injury Compression Abra o aneurisma mini-clipe modificado no suporte do clipe (Figura 2A13 e Figura 2B) e local the lâminas em cada lado da medula espinal, nos espaços entre a faceta junções e o cabo. Certifique-se de que as lâminas são inseridas profundamente o suficiente para afectar a parte ventral da medula espinal. Se isso não for possível, remova mais das articulações. Solte o mini-clipe rapidamente, segurando-o no lugar com o suporte do grampo para evitar que ele caia. Manter a compressão por 15 s. Abra o mini-clip rápida e removê-lo. Para alcançar uma compressão simétrica, inverter a orientação do mini-grampo, e usando a marca facilmente visto feito pelo edema hemorrágica da primeira compressão como um guia, reposicionar o clipe na orientação inversa, para uma segunda compressão de 15 seg (prévia experiência mostrou que isso gera déficits histológicas e fisiológicas simétricas, enquanto as compressões individuais não 1). A dura-máter não devem ser danificados pela compressão. Limpar a área e manter a hemostasia com pedaços de esponja de gelatina hemostática. Remover os pedaços de esponja de gelatina hemostática que foram colocados sob as bordas da incisão da pele no início da cirurgia e fechar a incisão na pele com estéril 6,0 sutura e um suporte de agulha (Figura 2A14 e 15). Injectar por via subcutânea 0,75 mg / kg de peso corporal de Buprenorfina (Figura 2A16) diluída em PBS estéril usando uma seringa de insulina (300 ul, 30 g). 6. Cuidados no pós-operatório Remover o rato da máscara do nariz e colocá-lo em um conjunto de câmara com temperatura controlada a 30 ° C até que a anestesia desgasta fora eo mouse torna-se alerta (1-3 hr é tipicamente suficiente). Injectar Diazepam (Figura 2B17) intraperitonealmente para a matriz (8 g / kg de peso corporal). Isto cria um torpor que diminui o risco de canibalismo durante a primeira noite, quando este risco é mais elevado. Retornar o mouse operado para a maca. Se o lixo é large (> 12 filhotes), remova alguns dos filhotes não operados, preferencialmente os animais maiores se eles diferem em tamanho, para reduzir a competição para o leite. cuidados maternos dos filhotes operados há de melhor na linha de ICR se o tamanho da ninhada é de cerca de 9 filhotes. Para a gestão da dor, administrar buprenorfina (0,75 mg / kg de peso corporal) por via subcutânea uma vez por dia durante os primeiros dias após a cirurgia, utilizando uma seringa de insulina (300 ul, 30 g). Um volume apropriado para a injecção subcutânea é de 30-50 ul. Em vocalização ratos neonatal e agitação são bons indicadores de dor. Realizar um exame diário dos ratinhos lesionados usando uma folha de pontuação para avaliar a nutrição, o peso corporal, desidratação, dor, cicatrização de feridas, a retenção de urina e estado da infecção. De acordo com a pontuação obtida, fornecer cuidados especiais, tais como injeções de uma solução estéril pediátrica nutrição (Tabela 1 # 18) em caso de alimentação anormal. A folha de pontuação também0; define critérios endpoint humanas. Uma mãe que não rejeita os filhotes feridos é o melhor cuidador. No caso incomum de disfunção da bexiga, realizar massagem de bexiga duas vezes por dia até que a função é restaurada. Isso é feito colocando o rato em decúbito dorsal em uma mão e massagear o abdômen inferior delicadamente em um sentido rostro-caudal usando a ponta dos dedos.