JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie und Infektion

İnsan Periferik Kan immünfenotipik Analizi Antikor Kokteyller Hazırlama A Yarı-otomatik Yaklaşım

Published: February 08, 2016
doi:
10.3791/53485
, , , , , ,
1Human Immune Monitoring Laboratory, Earle A. Chiles Research Institute,Providence Cancer Center, Providence Portland Medical Center, 2Sony Biotechnology, 3Beckman Coulter, Inc. Life Sciences, 4Bristol-Myers Squibb

Summary

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

Abstract

akış ile periferik kan İmmünofenotipleme sitometri hastalık ve tedavi sırasında periferik lökositlerin sıklığı ve aktivasyon durumundaki değişiklikleri belirler. Bu terapötik etkinlik tahmin ve yeni tedavi hedefleri tespit etme potansiyeline sahiptir. Tam kan boyama numune hazırlama sırasında meydana gelebilecek eserler minimize unmanipulated kan kullanır. Bununla birlikte, tam kan lekeleme da numunenin bütünlüğünü sağlamak için yeni toplanmış kan yapılmalıdır. Ayrıca, tandem-boyalar potansiyel istikrarsızlık önlemek ve parlak mor boyalar arasındaki reaktif etkileşimi önlemek için aynı gün antikor kokteyller hazırlamak için en iyisidir. Bu nedenle, tam kan boyama içi ve inter-deneysel değişkenliği kontrol etmek için dikkatli bir standardizasyon gerektirir.

Burada, Antibod yapma, standart bir işlemle bir iki boyutlu (2D) barkod okuyucu ile donatılmış bir otomatik sıvı işleyici dağıtım raporflow sitometri için y kokteyller. Antikorlar, bir veri tabanında bulunan derlenmiş, 96 gözlü bir format ve içerikleri düzenlenmiş 2D barkod tüplere transfer edilmiştir. Sıvı işleyici sonra veritabanı içinde antikor isimleri başvurarak kaynak antikor şişeleri bulmak olabilir. Bizim yöntem kaynak antikor tüplerin yerleştirilmesi için sıkıcı koordinasyon ortadan kaldırmıştır. Bu kullanıcının kolayca her bir deney için yazılım yönteminde komut yeniden yazmadan veritabanı değiştirerek bu tür spesifik kullanmak için antikor, ses ve hedef olarak antikor dağıtım sürecinde detayların herhangi sayısını değiştirmek için izin yönlülük sağladı.

kavram deney bir kanıtı deneyi sitometri 11 renkli, 17-antikor akışının tekrarlanan hazırlanması gösterdiği olağanüstü arası ve içi tahlil hassasiyet, elde etti. Bu metodolojiler deneyleri flow sitometri için genel verimliliği artmış ve ayrıntılı fenomenoloji için gerekli olan karmaşık antikor kokteyller günlük hazırlanmasını kolaylaştırmıştırtaze toplanmış Antikoagüle periferik kan typic karakterizasyonu.

Introduction

İnsan periferik kan İmmünofenotipleme immün hücre alt 1 nicel ve nitel değişiklikleri tespit eder. Bu eylem ve direniş, öngörü biyomarkırların yardımcıları keşif mekanizmaları içgörü sağlar ve kombinasyon immünoterapilerin gelişimini kolaylaştırır. Bu nedenle, immunfenotiplemenin doğrulama ve standardizasyon akademik araştırmacılar, klinik laboratuarlar ve sanayilere önemli bir ilgi alanıdır.

Akış sitometrik yöntemlerle periferik kan immünofenotipleme şu anda hematolojik malignitelerde 2,3 ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonu 4,5, immünoterapi talepleri için periferik kan güvenilir immünofenotiplendirme çünkü o doğrulama ve standardizasyon belirli düşüncelerin klinik yönetimi için kullanılmasına rağmen bağışıklık hücre alt grupları ve aktivasyon / inhibitör reseptörleri 1,6-8 üzerinde daha geniş kapsama alanı gerektirir. successful immünofenotiplendirme enstrüman kurulum ve hücre boyama işlemi 9,10 ilgili deney-to-deney değişkenliği en aza indirmek için dikkatli standardizasyon gerektirir. Flow sitometri için cihaz ayarlarının standardizasyon iyi eski endişe 9,11,12 adresine yerleşmiş olmakla birlikte, bağışıklık hücre alt ve aktivasyon durumu kapsama kısıtlamadan hücre boyama ile ilgili değişkenliği en aza indirmek için nasıl belirsizliğini korumaktadır.

antijenlerin sayısı artar tespit edilecek, bu nedenle de hata ve değişkenlik optimal reaktif dağıtılması ve çapraz kontaminasyon nedeniyle fırsatı yok. antikoagüle tam kan phenoptypic analiz yöntemleri klinik laboratuar deneylerinde kullanım için 1980'lerin sonunda tespit edilmiştir. Bu aynı yöntemler numune hazırlama için araştırma laboratuarında ihtiyaçlarına hizmet. Önemlisi, klinik laboratuvarda kullanılan antikor kokteyller tipik az karmaşık ve ava vardırilable önceden titre edilmiş ve üretici önceden karıştırılmış. önceden karıştırılmış antikor kokteylinin sadece tek bir transfer gereklidir. araştırma ortamında, 10-16 antikorların antikor kokteyller tipiktir. Her kokteyl laboratuar tarafından istikrar için onaylanmış veya her bir deneyde önce taze hazırlanmış olmalıdır. Bir örnek için birden fazla antikor kokteyller hazırlamak 50-80 bireysel antikorların pipetlenmesini, sıkıcı ve hata eğilimli hem bir görev gelmesine yol açabilir.

kokteyl hazırlama Otomasyon gibi daha az hata olarak manuel kokteyl hazırlama üzerinde birçok avantajı vardır, pipetleme doğruluğu artmış, ve hatta reaktif israfını azalmıştır. Burada, Numune Hazırlama ile ilgili değişkenliği en aza indirmek için immunfenotiplemenin hücre boyama işlemi bir iki boyutlu (2D) barkod okuyucu ile donatılmış bir otomatik sıvı işleyici başarılı bir giriş sunulmaktadır.

Protocol

Toplama ve bu protokolde periferik kan kullanımı Providence Health & Hizmetler Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylandı. Bütün insan denekler yazılı onam sağladı. Not: Evrensel Önlemler izleyin. Bütün insan kanı bulaşıcı ve Biyogüvenlik Seviye 2 uygulamalarına uygun olarak ele sanki tedavi edilmelidir. Not: Periferik tam kan ile immünofeotipleme alyuvarlar 'ı gidermek üzere hipotonik liziz ile ve ardından, hücre yüzey antijenlerini tespit için flüoresan etiketli monoklonal antikorlar, tam kanın pıhtılaşması önlenmiş inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Hücreler yıkanır ve örnek bir akış sitometresinde analiz edildi. Burada açıklanan yöntem 2D barkod okuyucu ile donatılmış otomatik sıvı işleyici kullanarak antikor kokteyl hazırlama odaklanır. İlk olarak, bağışıklık hücresi alt kümelerini belirler "Baz Kokteyl" ve i izler "Aktivasyon Kokteyl"nducible antijenler ayrıca (Tablo 1) elde edilmiştir. Sonra her iki kokteyller "Usta Antikor Kokteyl" oluşturmak için karıştırılır. Iş akışı için Bkz. Şekil 1 1. Numune Oda sıcaklığında tutun, sonra bir sodyum heparin Antikoagüle kan toplama tüpü Venipunktür yoluyla periferik kan toplayın uygun karışmasını sağlamak için hafifçe birkaç kez ters ve. Pıhtılaşmış veya 13 hemolize eğer numune reddet. 2. Laboratuvar Hazırlık Etiket 2D barkod insan tarafından okunabilir etiketlerle tüpler (antikor adı, işportacı, katalog numarası ve lot numarası). 2D barkod tüpleri karşılık gelen (Tablo 1'de) işportacı antikor şişeleri tüm içerik aktarmak. Not: yanlış kabarcıklar reaktif suboptimal transferi ile sonuçlanan sıvı seviye algılaması (LLS) tetikleyici olarak kabarcıkları tanıtmak değil son derece dikkatli olun. Not: emin olun her antikor viark çalıştırmak için yeterli bir antikor bulunur. 2D barkod okuyucu ile her tüp için 2D barkod okuyun. Bir tablo yazılımı kullanarak antikor isimleri (AB) ve barkod okuma içeren bir e-tablo (BC) yapın ve "AB_BC.csv" (Tablo 2) gibi bir virgülle ayrılmış değerler (CSV) dosyası olarak kaydedin. Not: Herhangi bir (örneğin, 0163562544) eğer barkod numaraları için ilk "0" tutmak için "Metin" değil "Number" olarak hücreleri biçimlendirmek için emin olun. veri sonunu belirtmek için sonunda "x, 0000000000" ekleyin. Otomatik sıvı hander güvertede çerçevesine vida LLS metal plakalar LLS sağlamaktır. Otomatik Sıvı Handler 3. Programlama Not: "Usta Antibo yapmak için" Temel Kokteyli "ve 3.1" Aktivasyon Kokteyli ") yapmak için a) yöntem ve b) yöntemi: iki yöntem otomatik sıvı işleyici için yazılımda programlanmış olacakBaz Kokteyli "ve" 3.2 Aktivasyon Cocktail ") (Şekil 1)" birleştirerek "dy Kokteyl. "Baz Kokteyli" ve "Aktivasyon Kokteyli" (Şekil 2) yapmak için bir yöntem oluşturun. Tablo: P50 ipuçları (BASE_CT_P50 ile "Temel Kokteyli" için ul antikor isimleri (AB_NAME), hedef tüp konumu (İYİ-BASE veya İYİ-ACT) ve hacim (VOL) için bilgileri içeren bir e-tablo yapmak, tablo yazılımı kullanarak 3) veya P200 ipuçları (BASE_CT_P200: Tablo 4) ve P50 ipuçları (ACT_CT_P50 ile "Aktivasyon Kokteyl": Tablo 5) ya da P200 ipuçları (ACT_CT_P200: Tablo 6). CSV dosyası olarak kaydedebilirsiniz. "İYİ BASE" ve "İYİ ACT" konum için Şekil 3'te numaralarını gösterir. Not: VOL = titre x ul (boyama + 2 arasında). Tablo 1'de titreleri çok özeldir. Operatör bir baştankara belirlemelidirher bir antikor için er Diğer 14 tarafından tarif edildiği gibi. "Baz Kokteyli" ve "Aktivasyon Kokteyli" yapmak için bir yöntem oluşturmak için bilgisayarda otomatik sıvı işleyici için yazılım başlatmak için bir simgeye tıklayın. Not: Laboratuvar belirleyecek 3.1.3-3.1.7 aşağıdaki adımları: 2D barkod tüpleri (Şekil 4) ile tüp raf. Ölçümler, bir referans olarak verilmiştir. Müfettişler belirlemek ve her araç için ayarlamanız gerekir. "Proje" kapsamında araç çubuğunda, "Laboratuvar Tipi Editor" seçeneğini seçin. "Kopyala" seçeneğini 96 de düz plaka için bir nesne üzerinde sağ tıklayın ve bir pop-up penceresi "Matrix_OneML_TubeRack" yazın. diyalog kutusunu açmak için nesne "Matrix_OneML_TubeRack" üzerine çift tıklayın. Vurgu "Temel bilgiler", 12,775 cm (X) ve "span" için 8,546 cm (Y) ve "Yükseklik" için 4,625 cm ayarlayın. (Şekil 4A). Sonra, vurgulamak "movement Bilgi "kıskaç sensörü kullan". Set Tutucu 0 (X), 0 (Y) ve 0.3 (Z), Tutucu kontrol, sonra Tutucu Unsqueeze 2.6 cm -0.1cm sıkıştırın Hız Sınırı% 75, ve offset "(Şekil 4B). Ardından, "Well_1" vurgulayın. Set şöyle: "Eh Ofset"; 1,5 cm (X) ve 1.13 cm (Y), "Eh Kont"; 12 (X) ve 8 (Y), "Eh Aralığı"; 0.9 (X) ve 0.9 (Y), "maksimum hacim"; 1.500 ul, Biçim ", Düzenli," Ofset Colum 2 ", 0, ve" Varsayılan Ses "; 0 (Şekil 4C). Son olarak, basın "İyi Yapılandırma" (Şekil 4C) sağında bir "Edit …" düğmesine basın. bir pop-up penceresi, set aşağıdaki gibi: "Shape"; Yuvarlak, "Üst Radius"; 0.37 cm, "Alt Radius"; 0.37 cm ve "Yükseklik"; 3.9 cm. "Alt Bölüm" ve set "Shape" kontrol edin; Koni, "Radius"; 0.37 cm ve "Yükseklik"; 0.4 cm (Şekil 4D). Not: mikrofüj tüpler tüp raf: Aşağıdaki adımlar 3.1.8-3.1.11 laboratuar aletlerinin tanımlayacaktır. Ölçümler, bir referans olarak verilmiştir. Müfettişler belirlemek ve her araç için ayarlamanız gerekir. "Proje" kapsamında araç çubuğunda, "Laboratuvar Tipi Editor" seçeneğini seçin. "Kopyala" ve tip "SmallTuberack_microfugetubes" seçeneğini, 24 pozisyon raf için bir nesne üzerinde sağ tıklayın. diyalog kutusunu açmak için nesne "SmallTuberack_microfugetubes" üzerine çift tıklayın. Vurgu "Temel bilgiler", 12.75 cm (X) ve "span" için 8.5 cm (Y) ve "Yükseklik" için 3.95 cm ayarlayın. Sonra, "Well_1" vurgulayın. Set şöyle: "Eh Ofset"; 1,621 cm (X) ve 1.181 cm (Y), "Eh Kont"; 6 (X) ve 4 (Y), "Eh Aralığı"; 1,9 (X) ve 1.9 (Y), "maksimum hacim"; 1.000 ul, Biçim ", Düzenli," Ofset Colum 2 ", 0, ve" Varsayılan Ses "; 0. Son olarak, basın"Eh Yapılandırması" sağında "Edit …" düğmesine basın. bir pop-up penceresi, set aşağıdaki gibi: "Shape"; Yuvarlak, "Üst Radius"; 0,3345 cm "Alt yarıçapı"; 0.274 cm ve "Yükseklik"; 3,6728 cm. "Alt Bölüm" ve set "Shape" kontrol edin; Yarımküre ve "Radius"; 0,1575 cm. Not: Aşağıdaki adımlar 3.1.12-3.1.35 "Baz Kokteyli" ve "Aktivasyon Kokteyli" (Şekil 2) yapmak için "Yeni Bir ​​Yöntem" program açıklayacağız. "Yeni Yöntemi" ikonuna ve açık tıklayın. Yeni yöntemde bir "Başlat" ve "Finish" simgesi (Şekil 2) arasında bir "IF" simgesine sürükleyin. Tıklayın ve "IF" simgesini vurgulayın. Durumu için aşağıdakileri yazın:. CreateObject ( "World.EngineObject") simüle Not: Bu hata denetimi gerçekleştirmek yazılım önlemek ve çözüm için bu yöntemi sağlayacaktır. Bu adım olmadan, s3.1.20 açıklanan): Barkod adım "barkod Oku VisionMate" sonra yalnızca kullanılabilir okur gibi oftware veri kümesi için eksik bilgiler uyaracaktır. Bu adım yazılımın doğrulama adımını devre dışı olduğundan, operatör bu yöntemi gerçekleştirmek için güvertede yeterli ipuçları ve reaktif vardır onaylamanız gerekir. "EĞER" simgesi (Şekil 2) altında "Sonra" simgesi ve ilk "End" simgesi arasında bir "Cihaz Kurulumu" simgesini yerleştirin. Not: Aşağıdaki tüm adımlar için, "Else" simgesi ve "IF" simgesinin altındaki ikinci "End" simgesi arasındaki sürükle simgeleri adımlar "Else" kapsüllü böylece. Yönteminde "Else" simgesini (Şekil 2) altında "Cihaz Kurulumu" simgesine sürükleyin. penceresini açmak için yönteminde "Cihaz Kurulumu" ikonuna tıklayın. P50 LLS süzülmüş ipuçları için simgeleri sürükleyerek labwares yapılandırın, P200 LLS süzülmüş ipuçları, P1000 ipuçları, "Matrix_OneML_TubeRack", iki "SmallTuberack_microfugetubes" ve simge listesinden ilgili güverte konumu rezervuar. "AB_BOX" olarak "Matrix_OneML_TubeRack" ve adı diyalog kutusunu açın. "SmallTuberack_microfugetubes" için diyalog kutusunu açın ve Baz kokteyller "BASE_CT" ve Aktivasyon kokteyller için "ACT_CT" gibi diğer (Şekil 5) olarak bir isim. "Baz Kokteyli" ve "Aktivasyon Kokteyli" için mikrofüj tüplerine hazneden tampon aktarmak için bir adım eklemek için yöntemiyle (Şekil 2) bir "Transferi" simgesine sürükleyin. Aktarım hacmi = 25 ul x "Baz Kokteyli" ve = 25 ul x (+2 lekelenme #) "Aktivasyon Kokteyli" için (+2 boyama arasında). 2D barkod okuyucu üzerine "Matrix_OneML_TubeRack" taşımak için adımlar ekleyin. (Yöntemine Fi bir "VisionMate Taşı" simgesine sürükleyinşekil 2) ve güvertede barkod okuyucu konumuna ilk güverte konumundan hareket belirtin. Bir "VisionMate: barkod okuma" Drag yöntemiyle (Şekil 2) simgeyi. diyalog kutusunu açın ve aygıtı olarak "VisionMate" seçin ve "BC_Read" olarak ayarlanmış verileri adlandırın. Bir "Kullanıcı Duraklama" (Şekil 2) sürükleyin seçeneğini "tüm sistemi Pause ve bu iletiyi görüntülemek" ve tüm barkodlar sonraki adıma geçmeden önce okunan teyit kullanıcıları hatırlatmak için alana bir açıklama yazın. Not: Aşağıdaki adımlar 3.1.22-3.1.26 barkod bilgilerini kullanarak kuyu yerleri ve antikor isimler arasında bağlantı olacak. Bu antikor adı "AB" dayalı belirli antikorun bir yer bulmak için otomatik sıvı işleyici sağlayacaktır. Yöntemiyle (Şekil 2) bir "Raporlama Adım" simgesine sürükleyin. Bir metin programı kullanarak bir metin dosyası oluşturun ve kaydedinbilgisayardaki belge klasöründe "BC_Readout" olarak. "Adım Raporlama" için diyalog kutusunu açın Rapor Style "Metin dosyası" seçin ve tarama yoluyla "BC_Readout" dosyasını seçin. Not: barkod bilgi "Matrix_OneML_TubeRack" 2D barkod tüpleri ve iyi yerler için okuma da dahil olmak üzere 3.1.16 yapılandırıldığı gibi sonuçlanan "BC_Readout" dosya ipuçları dışında güvertede tüm labwares için bilgileri içerir. barkod ve iyi bilgi bağlamak için bir "Veri Kümesi Oluşturma" adımı ekleyin. Yönteme "Create Data Set" simgesine sürükleyin (Şekil 2), "bir dosyadan oku" seçin ve "AB_BC.csv" seçeneğini diyalog kutusunu açmak için tıklayın (2.4 oluşturulan Tablo 2), "virgül kontrol ayrılmış "ve" dosya bir başlık satırı "vardır. Not: Dosya Önizleme penceresinde, antikor isimler (AB) ve barkod görülmelidir (BC) okur. s olarak3.1.25 yılında "Create Veri Seti" için ame diyalog kutusu, laboratuvar konumu için "VM1'i" seçin ve "0" yığın derinliği seçin "Örnek Kimliği Maç", ve saha "BC" kullanmak Verilerle maç "BC_Read" olarak ayarlayın. "AB" ve "Veri düzenlendi To Be ayarlar" için "BC" (Şekil 6) seçin. Yöntemiyle (Şekil 2) bir "VisionMate Taşı" simgesini sürükleyin ve arka Güvertede ilk güverte konumuna barkod okuyucu konumunda "VM1" dan hareket belirtin. Not: Aşağıdaki adımlar 3.1.28-3.1.33 "Baz Kokteyli" için transfer adımını tanımlayacaktır. Bir "Worklist" simgesine (Şekil 2) sürükleyin ve 3.1.1 oluşturulan iş listesi dosyası "Base_CT_P50" (Tablo 3) seçmek için gözatın. "Döngü tüm iş listesi" kontrol edin. "Worklist" simgesi altında doğrudan "Transferi" simgesine sürükleyin (Şekil 2). </ Li> şartname alan açmak için "Transferi" simgesine tıklayın. seçin "bunları kaldıramıyor", prob sadece birini, ip uçları süzülmüş P50 LLS seçmek transferi yapılır ve "transferler arasında geçiş ipuçları" kontrol edildiğinde. tıklayarak kaynağını ekle ismi "AB_BOX" tarafından güvertede bir laboratuvar basıp konum olarak "Matrix_OneML_TubeRack" seçeneğini "bir kaynak eklemek için buraya tıklayın". "Transfer" için şartname alanında, "Yakınlaştır" sağ tıklayarak 96 kuyu diyagram üzerinde ve hemen "Use Veri Seti" sonra "AB" seçin ve değerleri ve "= AB_NAME" "eşittir" yeri seçin . seçim seçin transfer tekniği. Not: LLS kullanımı son derece altına yakın çöktürülmüş enkaz almamak için tavsiye edilir. "Transfer", tıklayarak seçin hedef için şartname alan "Bir hedef eklemek için buraya tıklayın", sağ yakınlaştırmak için tıklayın ve "SmallTuberack_ seçinmicrofugetubes "bir laboratuvar olarak, olarak hacim" BASE_CT "adı ile güvertede ve konumu" = VOL metin olarak Seçimi belirtin ". uzaklaştırma sonra kontrol tekrar sağ tıklayın ve" ", ve kontrol" ifadesi hedefler belirleyin aşağıda: hedef güverte pozisyonu için bir değişken olarak "ve tip" = WELL_BASE ". Daha sonra P200 LLS süzülmüş ipuçları için ipuçları yanı sıra uygun pipet tekniği süzülmüş P200 LLS seçin csv dosyası "Base_CT_P200" (Tablo 4) seçerek, benzer P200 ipuçları ile "Temel Kokteyli" için 3.1.29-3.1.32 tekrarlayın. Not: Aşağıdaki adımlar 3.1.34 ve 3.1.35 "Aktivasyon Kokteyli" için transfer adımını tanımlayacaktır. Bir hedef olarak "ACT_CT" csv dosyası "ACT_CT_P50" (Tablo 5) seçme ve seçerek, benzer P50 ipuçları "Aktivasyon Kokteyli" için 3.1.29-3.1.32 tekrarlayın. Sağ hedef tıklayın ve kontrol "metin olarak Seçimi belirleme";. Kontrol "Aşağıdaki ifade ile hedefler belirleyin:" ve türünü "= WELL_ACT" Bir hedef pozisyonu için bir değişken olarak. Csv dosyasını "ACT_CT_P200" (Tablo 6) ve P200 LLS süzülmüş ipuçları seçerek, benzer P200 ipuçları "Aktivasyon Kokteyli" için 3.1.34 tekrarlayın. Not: "Baz Kokteyli" ve "Aktivasyon Kokteyli" yapmak için bir yöntem kaydettikten sonra kapatılabilir. 5 ml yuvarlak alt polistiren tüpler (Şekil 7) içine "Baz Kokteyli" ve "Aktivasyon Kokteyli" birleştirerek "Usta Antikor Kokteyl" yapmak için yeni bir yöntem oluşturun. Not: 5 ml yuvarlak dipli polistiren tüpler tüp raf: Aşağıdaki adımlar 3.2.1-3.2.6 laboratuar aletlerinin tanımlayacaktır. Sayılar referans için verilmektedir. Müfettişler belirlemek ve enstrüman için ayarlamanız gerekir. "Proje" kapsamında araç çubuğunda, "Laboratuvar Tipi Editor" seçeneğini seçin. Sağ cl24-pozisyon raf için bir nesne üzerinde Tran, "Kopyala" öğesini seçin ve bir pop-up penceresi "BiocisionCoolRack_XT" yazın. diyalog kutusunu açmak için nesne "BiocisionCoolRack_XT" üzerine çift tıklayın. Vurgu "Temel bilgiler", 12.78 cm (X) ve "span" için 8.57 cm (Y) ve "Yükseklik" için 7.93 cm ayarlayın. "Well_1" vurgulayın. Set şöyle: "Eh Ofset"; 1.55 cm (X) ve 1.33 cm (Y), "Eh Kont"; 6 (X) ve 4 (Y), "Eh Aralığı"; 1.95 (X) ve 1.97 (Y), "maksimum hacim"; 2.000 ul, Biçim ", Düzenli," Ofset Colum 2 ", 0, ve" Varsayılan Ses "; 0. düzenlemek için "Eh Yapılandırması" açın. "Şekil"; aşağıdaki gibidir: Set Yuvarlak, "Üst Radius"; 0,5375 cm "Alt yarıçapı"; 0.48 cm ve "Yükseklik"; 7.07 cm. "Alt Bölüm" ve set "Shape" kontrol edin; Yarımküre ve "Radius"; 0.45 cm. Not: Aşağıdaki adımları3.2.6-3.2.7 aktarım adımları tanımlayacak ve aşama 3.2.14 kullanılabilir. Aşağıdaki başlıklarla antikor kokteyli yapmak için bir csv dosyası "AB_MACT" (Tablo 7) oluşturun: a) "SRC_BASE"; "Baz Kokteyl", b) "WELL_BASE" için bir laboratuvar adı; "Baz Kokteyl", c) "VOL_BASE" için laboratuvar iyi yerler; ul içinde "Baz Kokteyl", d) "SRC_ACT" için transfer hacmi; "Aktivasyon Kokteyl", e) "WELL_ACT" için bir laboratuvar adı; "Aktivasyon Kokteyl", f) "VOL_ACT" için laboratuvar iyi yerler; ul içinde "Aktivasyon Kokteyl", g) "DEST_MACT" için transfer hacmi; "Usta Antikor Kokteyl", ve h) "WELL_MACT" için güverte konum bilgisi; iyi "Usta Antikor Kokteyli" için tüp rafa bilgi yerleştirin. A) "BASE_CT" kullanın aşağıdaki gibidir: 3.2.6 oluşturulan başlıklarını) (Tablo 7) altında bilgileri doldurunŞekil 3A'da gösterildiği gibi, "WELL_BASE" için SRC_BASE altında b) listesi de konum bilgilerini, c) antikor listesi toplam hacmi ( "VOL_BASE" altında, bir boyama için tüm ana antikor titerlerinin) tampon + toplamı 25 ul, d); kullanımı Şekil 3B'de, antikor, f) toplam hacmi ( "VOL_ACT" altında, bir boyama seyahati aktivasyon antikor titrelerinin) tampon + toplamı 25 ul 'de gösterildiği gibi "WELL_BASE" için SRC_ACT e) listesi de yer bilgisi kapsamında "ACT_CT". Aktarım T hücre FM3 için tampon 25 ul. Şekil 8'de gösterildiği gibi "WELL_MACT" için "DEST_MACT" için "SPL_TUBES_1" (3.2.10 bakınız), ve h) listesi de konum bilgisi kullanmak Testler 1-3, g) için Tablo 1'e bakınız. Not: Aşağıdaki adımlar 3.2.8-3.2.15 "Usta Antikor Kokteyl" yapmak için bir yöntem programlayacaksınız Yeni bir yöntem (Şekil 7) açar. "Instr sürükleyinYeni yönteme ument Kur "simgesi (Şekil 7). güverte diyagram üzerine "Enstrüman Kur" P1000 ipuçları için, sürükle simgeleri, iki "SmallTuberack_microfugetubes" ve "BiocisionCoolRack_XT" nin şartname alanında. 3.1.17 belirtilen, sırasıyla "BASE_CT" ve "ACT_CT", iki "SmallTuberack_microfugetubes" ve adı diyalog kutusunu açın. 3.2.7 (Şekil 9) belirtilen "SPL_TUBES_1" olarak diyalog "BiocisionCoolRack_XT" kutusunu ve ismini açın. Yöntemiyle (Şekil 7) bir "Grup" simgesini sürükleyerek yeni bir "Grup" ekleyin. "Usta Antikor Kokteyl" (Şekil 7) yapmak için "Baz Kokteyl" transfer doğrudan "Grup" simgesi altında "Transferi Dosyadan" simgesine sürükleyin. "Dosyadan Transferi" için şartname alanında, s kullanımda P1000 ipuçları seçinseçecek "bunları kaldıramıyor" transfer yapılır ve "transferler arasında geçiş ipuçları" kontrol edildiğinde. "Dosyadan Transferi" için şartname alanında, tarama dosyayı "AB_MACT" (Tablo 7) seçeneğini işaretleyin "Dosya bir başlık satır vardır". Kaynak laboratuvar pozisyon için "SRC_BASE" ve kaynak laboratuvar iyi bilgi için "WELL_BASE" seçeneğini seçin, hedef laboratuvar için "DEST_MACT" ve hedef laboratuvar iyi bilgi için "WELL_MACT" seçin ve (ses bilgisi için Şekil "VOL_BASE" seçeneğini 10). P1000 ipuçları için uygun aktarım tekniğini seçtik. Not: LLS bu işlem için gerekli olmayabilir. Doğrudan "Usta Antikor Kokteyl" yapmak için "Baz Kokteyli" ile karışık olmaktır "Aktivasyon Kokteyl" transfer "Grup" altında sürükleyerek başka bir "Dosyadan Transfer" Ekle (Şekil 7 </ Strong> '). Benzer 3.2.13 ve 3.2.14 gibi aktarma adımını oluşturdu. aşağıdaki gibi özel durumlar şunlardır: a) Kaynak laboratuvar iyi bilgi kaynağı laboratuvar pozisyon için "SRC_ACT", b) "WELL_ACT" seçin ve hacim bilgileri c) "VOL_ACT". 4. Çalışma Prosedürü İlk olarak, bilgisayarda 2D barkod okuyucu başlatmak için yazılım simgesine çift tıklayın. Ardından, bilgisayarda otomatik sıvı işleyici başlatmak için yazılım simgesine çift tıklayın. "Enstrüman" altında, otomatik sıvı işleyici asal şırınga "Ana Sayfa Tüm eksenler" seçeneğini seçin. Tüm şırıngalar hiçbir görünür hava kabarcıkları içerdiğinden emin olun. Not: "Ana Sayfa Tüm Axes" ayrıca gösterge sonraki hamle yapmak için bir referans noktası verecektir. A için yazılımda (Şekil 2) "Temel Kokteyli" ve "Aktivasyon Kokteyli" yapmak için bir yöntem açınutomated sıvı işleyici. "BASE_CT" ve yapılacak "Baz Kokteyli" ve "Aktivasyon Kokteyli" sayısına göre "ACT_CT" için "SmallTuberack_microfugetubes" (Şekil 3) içine mikrofuge'ye tüplerini yerleştirin. Sonra "Enstrüman Setup" (Şekil 5) 'e göre güverte üzerine koyun. "Cihaz Kurulumu" na göre güvertede tamponu ile rezervuar yerleştirin. De-cap 8-kanal vidalı kapaklı decapper kullanarak antikorları içeren 2D barkod tüpler. Çapraz bulaşmayı önlemek için bir kap tutan tepsi üzerinde tam sırası kapaklarını tutun. "Enstrüman Setup" (Şekil 5) 'e göre güvertede "Matrix_OneML_TubeRack" koyun. "Enstrüman Setup" (Şekil 5) 'e göre güvertede yer P50 LLS süzülmüş ipuçları, P200 LLS süzülmüş ipuçları ve P1000 ipuçları. Yeşil tri tıklayarak yöntemi başlayınaçı şeklinde başlangıç ​​simgesi. pop-up pencere tarafından istendiğinde, yöntemde tanımlandığı gibi güvertede tüm öğeleri "Enstrüman Kur" uyduğundan emin olun. Bu bölmeyi ve / veya kıskacı ezmek olabilir gibi, güvertede "Enstrüman Setup" yer almayan herhangi bir nesne koymayın. "OK" devam etmek. "Matrix_OneML_TubeRack" 2D barkod okuyucu üzerine taşınır ve barkodlar okunduktan sonra, başka bir pop-up penceresi tüm barkodlar okunur olup olmadığını soracaktır. "Tamam" tuşuna basarak devam edin kez doğruladı. otomatik sıvı işleyici tarafından transferi tamamlandıktan sonra, 8-kanal vidalı kapaklı decapper kullanarak 2D barkodlu tüpleri recap ve geri 4 ° C'ye koydu. Vortex tüm mikrofüj tüpleri kuvvetlice 20 saniye, ve tüp rafları içine dönmek. Not: Yetersiz vorteksleme hücrelerin optimal lekelenme ile sonuçlanabilir. "Baz Kokteyli" ve "Aktivasyon Kokteyli" yapmak için bir yöntem kapatın. Ardından "Usta Antikor Kokteyl" yapmak için bir yöntem açın. "BiocisionCoolRack_XT" (Şekil 8) önceden etiketlenmiş 5 ml yuvarlak dipli polistiren tüpleri kurmak ve güverte üzerine yerleştirin. Etiketler "Baz Kokteyl" ve "Aktivasyon Kokteyl" de uygun hasta kimliği olarak, karışık ne belirtmelidir. Güvertede "Baz Kokteyl", "Aktivasyon Kokteyl", ve P1000 ipuçları (Şekil 9) için tüp rafları yerleştirin. Yöntemi (Şekil 7) Başlangıç. Pop-up pencere tarafından istendiğinde, emin olun yöntemi güverte maçı Enstrümantal Kur ürün (Şekil 9) söyledi. "OK" devam etmek. Yukarıdaki süreç tamamlandığında, el antikor kokteyli içeren her 5 ml yuvarlak alt polistiren tüp içine kan örneklerinin 50 ul ekleyin. Sınıf II biyolojik güvenlik kabini içinde vorteks örnek tüpleri ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. TakBu tutarsız boyamanın neden olacaktır e bakım, tüplerin tarafta kan çizgiler önlemek için. Dikkatle akış yıkama tamponu ile nemlendirilmiş pamuklu kanın herhangi bir çizgileri kaldırın. RBC liziz tamponu için 1 ml el ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. 400 x g, 5 dakika için akış yıkama tamponu (% 0.1 sodyum azit,% 1 BSA, 1 x HBSS, 10 U / ml heparin) ve santrifüj 2 ml ilave edilir. Sınıf II biyolojik güvenlik kabini içinde süpernatant atın. Bu yıkama işlemi tekrarlayın. Yeniden askıya akış yıkama tamponu 0.5 ml lekeli hücrelerin. kurmanızı sitometresi bir akış un lazerler ve uygun filtreler ve 5 ml yuvarlak dipli polistiren tüpler kullanılarak işletilen numuneler ile donatılmıştır. Bilgi toplama 12,15 standart sitometresinin kalibrasyon ve floresan tazminat yöntemlerini kullanın. Tablo 1'de "fluorofor" bölümünde listelenen tüm parametreleri toplayın. Not: Uygun kontrol malzemeler uygun eşek sağlamak için her çalışma kullanılmalıdıray performans. çalışan örneklerin sonra, ihracat fcs dosyaları gibi verileri elde etti. Uygun yazılım kullanarak verileri analiz edin. İnsan İmmünoloji Projesi 1 ile özetlenen bir yolluk strateji kullanarak T hücre alt grupları belirlemek.

Representative Results

tam kan immunfenotiplemenin hedefi nicel (bağışıklık hücre alt sınırlarının çizilmesini) ve bağışıklık hücreleri üzerinde kalitatif (aktivasyon durumu algılama) bilgi elde etmektir. Biz biraz bizim yöntemle (Tablo 1) genel performansını artırmak için İnsan İmmünoloji Projesi 1 önerdiği T hücre immunofenotipleme paneli değiştirdiniz. Bizim T hücre paneli naif, merkezi bellek (CM), efektör bellek (EM) ve efektör T hücrelerini tespit etmeyi amaçlamaktadır. Kısaca, biz FCS-A ve FCS-H dayalı ikilileri ayrımcılık. tarafında dağılım ve CD45 düzeylerine göre lenfositler üzerindeki Sonra kapısı. T hücreleri, daha sonra CD3'e ekspresyonu ile tanımlanır. CD3 + T hücreleri γδ T hücreleri ve T hücreleri αβ ayrılır. αβ T hücreleri, CD4 + ve CD8 + T hücreleri ayrılırlar. CD4 + ve CD8 + T hücreleri, daha sonra expressio dayalı alt-gruplar için analiz edilirCD45RA ve CCR7 n: – CCR7 + CM, CD45RA + CCR7 + Naïve, CD45RA + CCR7 – CD45RA efektör ve CD45RA – CCR7 – EM T hücreleri 1. Ayrıca, biz de nitel bilgileri elde etmek için bu tür CD38, HLA-DR, ICOS, PD-1, GITR, 4-1BB, CD69, NKG2D ve OX40 olarak aktivasyon belirteçleri kendi ifadesini izlemek. Bu yöntemin hassasiyetini göstermek için, bir günde 4 sağlıklı donörlerden 5 kez periferik tam kan örnekleri lekeli. 11 kapılı lenfositler ve varyans (% CV) yüzde katsayısı yüzde T hücre ICSI'nin arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Geçitli lenfosit ve her alt kümesi için% CV yüzde T hücre alt ayrıntılı bir dökümü Testleri 2 8. Veri Tablo gösterilmiştir ve 3 Şekil 11 ve basitlik için Tablo 8'de dahil değildir. % 25'ten az CVrun (inter-analiz hassasiyet) arasında araştırma kullanımı 10 fenotipik biyomarker deneyleri için kabul kriterleri için öne sürülmüştür. Tüm ölçümler ICOS + γδ T hücreleri (26,64-46,39%. Tablo 8) ve ICOS + CD8 T hücrelerinin (14,64-58,39%. Tablo 8) dışında bu kriterleri bir araya geldi. Bu değerler gösteri amaçlı gösterilmektedir. ICOS esas olarak CD4 T hücrelerinin 16 aktivasyonunda önemli bir rol oynar, çünkü bu ölçümleri kullanmazlar. Toplam nüfus için düşük bir yüzde oluşturan toplumlarda daha yüksek% CV eğilim başkaları 7 tarafından izlendi. Vaka araştırmacılar nadir olayları izleme ilgilenen, hücrelerin sayısı arttıkça belirsizlik 17 aşmak için artırılması ihtiyaçlarını incelendi. Birlikte, bizim veri tam kan immunfenotiplemenin numune hazırlama otomasyon başarıyla dağıtılmasını gösterir. < img alt = "Şekil 1" src = "/ files / ftp_upload / 53485 / 53485fig1.jpg" /> Şekil periferik tam kan ile immünofenotiplendirme 1. iş akışı. Immünfenotipik testinin adım iş akışı Adım gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2. "Taban Kokteyli" ve "Aktivasyon Kokteyli" yapmak için yöntemin genel bakış. "Baz Kokteyli" ve otomatik sıvı işleyici için yazılımda "Aktivasyon Kokteyli" yapmak için yönteminde adımlar gösterilmektedir. Görüntülemek için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu. e 3 "src =" / files / ftp_upload / 53485 / 53485fig3.jpg "/> BACE_CT ve ACT_CT tüp raf Şekil 3. Düzen. (A) tüp raf "BACE_CT" için düzenini göstermektedir. (B) boru raf "ACT_CT" için düzenini gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 4. 2D barkod tüpler tüp raf için Laboratuvar tanım. 2D barkod tüpler tüp raf tanımlama adım süreci adım. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 485fig5.jpg "/> Şekil 5. "Baz Kokteyli" ve "Aktivasyon Kokteyli" yapmak için yöntem için Enstrüman kurulum. "Temel Kokteyli" ve "Aktivasyon Kokteyli" yapmak için yöntem için güverte düzenini gösterir. Tıklayınız Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için rakam. "Veri Kümesi Oluşturma" için Şekil 6. Kur. O "Create Veri Seti" için detaylı ayarı gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Figu "Usta Antikor Kokteyl" yapmak için yöntemin 7. Genel Bakış yeniden. otomatik sıvı işleyici için yazılımda "Usta Antikor Kokteyl" yapmak için yönteminde adımlar gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 5 ml yuvarlak dipli polistiren tüpler tüp raf 8. Düzen. Bu tüp raf "SPL_TUBES_1" için düzenini göstermektedir. FM3 floresan eksi 3 (parlak mor 421, fikoeritrin ve allofikosiyanin) anlamına gelir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. ftp_upload / 53485 / 53485fig9.jpg "/> Şekil 9. "Usta Antikor Kokteyl" yapmak için yöntem için Enstrüman kurulum. It "Usta Antikor Kokteyl" yapmak için yöntem için güverte düzenini gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. "Dosyadan Transferi" 10. Kur rakam. Bu "Dosyadan Transferi" için detaylı ayarı gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 11. Düşük vari yarı-otomatik tam kan immünofenotiplendirme içinde yeteneği. Dört sağlıklı donörlerden analiz tüm hücre popülasyonlarının Tek CV değerleri mavi, açık daire olarak gösterilmektedir. Regresyon eğrisi mavi çizgi gösterilir. Kırmızı çizgiler% 95 güven bantları ve açgözlülük noktalı çizgiler% 95 tahmin bantları göstermek işaret noktalı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 12. suboptimal lekelenmesi. Boyama bir örnek "BACE_CT" ve "ACT_CT" den mikrofüj tüpler yeterli veya yetersiz vorteks ile yapılmıştır. B iki geçitli popülasyonlar vardır. Zayıf CD45 boyama ile küçük nüfus optimum boyama alamadım hücreleri temsil eder.g12large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. GRUP İŞARETLEYİCİ fluorofor Klon Titre (ul / boyama) TABAN KOKTEYLİ TCELL CD45 FITC 2D1 0.4 CD3 Alexa700 UCHT1 1 CD8 APC-H7 SK1 0.4 CD4 PerCP-Cy5.5 SK3 2 CCR7 PE-CF594 150.503 1 CD45RA PE-Cy7 L48 1 TCRab BV786 </Td> T10B9.1A-31 1 TCRgd BV650 B1 5 AKTİVASYON KOKTEYLİ-1 TEST1 HLA-DR BV421 G46-6 5 CD278 (ICOS) PE DX29 5 CD38 APC HB7 1 AKTİVASYON KOKTEYLİ-2 TEST2 CD279 (PD1) BV421 EH12.1 2.5 CD357 (GITR) PE eBioAITR 5 CD137 (41BB) APC 4B4-1 10 AKTİVASYON KOKTEYLİ-3 TEST3 CD69 BV421 FN50 1 </Td> CD314 (NKG2D) PE 1D11 2 CD134 (OX40) APC ACT35 5 Tablo 1. modifiye T hücresi paneli için bir antikor listesi. AB M.Ö. CD45_FITC 0163562388 CD3_Alexa700 0163562110 CD4_PerCP_CY5.5 0163562364 CD8_APC-H7 0163562363 CCR7_PE-CF594 0163562387 CD45RA_PE-Cy7 0163562091 TCRab_BV786 0163562069 TCRgd_BV650 0163562108 <td> A_HLA-DR_BV421 0163562339 A_CD278 (ICOS) _PE 0163562082 A_CD38_APC 0163562317 A_CD279 (PD1) _BV421 0163562340 A_CD357 (GITR) _PE 0163562093 A_CD137 (41BB) _APC 0163562315 A_CD69_BV421 0163562341 A_CD314 (NKG2D) _PE 0163562314 A_CD134 (OX40) _APC 0163562316 2D barkod numaraları ile Tablo 2. Antikor adları. GRUP WELL_BASE AB_NAME VOL TCELL 1 <td> CD8_APC-H7 7.2 TCELL 1 CD45_FITC 7.2 TCELL 1 CD3_Alexa700 18 TCELL 1 CCR7_PE-CF594 18 TCELL 1 CD45RA_PE-Cy7 18 TCELL 1 TCRab_BV786 18 Tablo 3. Bir dosya "BASE_CT_P50": antikor isimleri ve hacim bilgileri. GRUP WELL_BASE AB_NAME VOL TCELL </td> 1 CD4_PerCP_CY5.5 36 TCELL 1 TCRgd_BV650 90 Tablo 4. Bir dosya "BASE_CT_P200": antikor isimleri ve hacim bilgileri. GRUP WELL_ACT AB_NAME VOL TEST1 7 A_HLA-DR_BV421 30 TEST1 7 A_CD278 (ICOS) _PE 30 TEST1 7 A_CD38_APC 6 TEST2 13 A_CD279 (PD1) _BV421 15 TEST2 13 A_CD357 (GITR) _PE 30 TEST3 19 A_CD314 (NKG2D) _PE 12 TEST3 19 A_CD69_BV421 6 TEST3 19 A_CD134 (OX40) _APC 30 Tablo 5. Bir dosya "ACT_ CT_P50": antikor isimleri ve hacim bilgileri. GRUP WELL_ACT AB_NAME VOL TEST2 13 A_CD137 (41BB) _APC 60 Tablo 6. Bir dosya "ACT_CT _P200": antikor isimleri ve hacim bilgileri. Donör # SRC_ BASE TABAN KOKTEYLİ WELL_ BASE VOL_ BASE SRC_ACT aktive VATION KOKTEYL WELL_ ACT VOL_ACT DEST_MACT WELL_ MACT HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 </td> 1 HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 7 HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 13 HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 19 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 2 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 <td> ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 8 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 14 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 20 HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 3 HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 9 <tr> HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 15 HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 21 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 4 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 10 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 </td> 13 42.5 SPL_TUBES_1 16 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 22 Tablo 7. Bir dosya "AB_MACT": "Usta Antikor Kokteyli" için kaynak ve hedef bilgileri. Şekil Nüfus #. 1 ben ii iii iv v Nüfus adı CD3 + ab T hücreleri GD T hücreleri CD3 + CD4 + CD3 +, CD8 + lenfositlerin% </Td> Heathly donör 1. 79.80 75.20 2.70 49.60 22.30 Heathly donör 2. 69.40 61.90 5.85 44.40 16.20 Heathly donör 3. 75.80 69.60 4.75 42.00 23.50 Heathly donör 4. 77.20 73.50 1.98 52.70 18.90 %ÖZGEÇMİŞ Heathly donör 1. 1.42 1.58 3.70 2.50 1.56 Heathly donör 2. 2.48 2.39 5.74 2.82 2.41 Heathly donör 3. 1.15 1.40 6.32 1.42 2.72 Heathly donör 4. 0.81 0.94 5.45 1.20 1.44 Ortalama 1.47 1.58 5.30 1.99 2.03 Standart sapma 0.72 0.61 1.13 0.79 0.63 Testlerin 2 ve 3 için veri veri sunumu basitleştirmek için Şekil 5 ve Tablo 8'de gösterilen olmadığını Şekil 4. Not çizilen her alt kümesi için lenfositler ve% CV% Tablo 8. Ham veri.

Discussion

Periferik kan İmmünofenotipleme immünoterapi bireysel tepkiler içgörüler kazanmak için büyük önem taşımaktadır. Meydan deneme-to-deney değişkenlik 1,14 kontrol etmek için deney standardizasyonu yatıyor. değişkenlik bir ana kaynağı örnekleri arasında insan manipülasyonu yatmaktadır. Nedenle, örnek işleme kısmi veya tam otomasyon deneme-to-denemede değişkenliği 1,14 dramatik bir azalma kolaylaştıracak düşünülebilir. Bu protokol, biz tam kan immünofenotiplendirme örnek boyama 2D barkod okuyucu ile donatılmış otomatik bir sıvı işleyici getirerek tahlil değişkenliği en aza indirmek için başarılı bir çaba rapor.

tasarımda, bizim yöntem çok yönlüdür ve onları tanımlamak için ek "Baz kokteyli" ekleyerek diğer bağışıklık altkümelerini izleyebilirsiniz. Bu alt-gruplar T yardımcı hücreleri, regülatör T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri, dendritik hücreler ve monositler (el yazması dahilHazırlık) 18. Biz ek işaretçileri 1 tanıtarak konsorsiyumun tavsiye edilen antikor paneller uyarlanmış. Biz uyarılabilir antijenlerin tespiti için bu kanalları ayırmak istediği gibi hücre popülasyonları, dedektörleri parlak mor 421 (BV421) içine en az emisyonla fluorochromes konjuge "Baz Kokteyl", fikoeritrin (PE) kullanılarak tespit ve allofikosiyanin (APC) bulundu. Bu özellik, bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu durumunu izlemek için yüksek duyarlılık sağlayan, ancak, aynı zamanda, bu üç fluorochromes en sık olarak uyarılabilir belirteçleri karşı antikorlar ile eşlenik olarak yeni bir aktivasyon işaretleme maddelerinin esnek konaklama sağlar sadece. Bu nedenle, yöntem, sadece tam kan immünofenotiplendirme kokteyl hazırlanması için uygun olan, fakat, aynı zamanda tasnif edilmiş dokular (örneğin, tümör) elde periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ve hücreler de dahil olmak üzere, diğer örnekleri boyama için kullanışlıdır.

başarılı introBizim yöntemin duction özel laboratuvar hazırlık adımlara dikkat ve programlama ve yöntemin uygulanmasını gerektirir. 2D barkod tüplerin hazırlanması insan tarafından okunabilir etiket ve belirlenen tüplere antikorların aktarılması ile etiketleme içerir. hataların girişini önlemek için, biz iki kişi ile bunu tavsiye ederiz. elektronik tablolar değiştirirken, araştırmacılar yöntemi düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol etmelidir. programlama sırasında uygun pipetleme yöntemleri seçme başarılı sıvı aktarımı sağlar. LLS biz P50 veya P200 iletken ipuçları birini kullanın hangi antikor tüpleri, altından çöktürülmüş enkaz almadan pipetleme sağlar. LLS P1000 ipuçları ile daha hassas ve bazen yanlış kabarcıklarının varlığı ile tetiklenen olarak LLS P1000 ipuçları için iyi bir seçenek olmayabilir. ipuçları kenarı arasında yeterli boşluk yoksa laboratuvar tanımı Heights, örneğin, olduğu gibi optimal sıvı transferi meydana gelebilir her araç için ayarlanabilir olmalıdırve tüplerin alt. Şekil 12'de gösterildiği gibi, "Base kokteyl" ve / veya "Aktivasyon kokteyl" İyice vortekslendi takdirde, bu optimal lekelenme neden olabilir.

Biz reaktif 19 dağıtım ile ilgili değişkenliği azaltmak için alternatif bir yaklaşım olarak hücre boyama Liyofilize reaktifler kullanılarak düşündüm. Bununla birlikte, parlak mor boyalar polimer konjugeleri birbirlerine neden spesifik olmayan sinyal ile etkileşim için bilinmektedir. Bu şekilde, liyofilize edilmiş reaktifler fazla iki polimer konjügatları (örneğin, BV421 ve BV650 gibi) spesifik olmayan sinyal neden olabilir eklenmesi (örneğin, BV421 + popülasyonda BV650 plan sinyalinin artış) 20. Ayrıca, liyofilize reaktifler, yeni boyama dahil olmak üzere esnekliği eksikliği. Genellikle daha pahalıdır ve bir toplu sipariş gerektirir. Bu nedenlerden dolayı, 2D barkod tüpleri ile donatılmış otomatik sıvı işleyici kullanmayı seçti. o t rağmenakes zaman kurmak ve bu faktörlerin verimlilik artışı ve testlerin tekrarlanabilirliği ile telafi edilecektir uzun vadede, enstrüman satın almak için bir ön yatırım gerektirir için. Aslında, bir kaç gruplar önceden immünofenotiplendirme veya benzeri uygulamalar 21,22 onların iş akışı içine otomatik sıvı işleyici başarılı entegrasyon bildirdi. flow sitometri analizi için otomatik çözümler de ticari kaynaklardan (FACS SPA III, Otomatik Kokteyl Hazırlama İstasyonu ve FlowStainer) edinilebilir. Bu da immünofenotiplendirme için otomatik bir kokteyl hazırlanması için büyük bir ihtiyaç olduğunu gösteriyor.

Bu tekniği mastering sonra, biz tam otomatik tam kan immunfenotiplemenin gelişimi, deneme-to-denemede değişkenliği azaltacak ve hatta 23 ayar çok merkezli klinik çalışmada tam kan immünofenotipleme mümkün hale olabilir öngörülüyor. Biz zaten bir lize oldu kullanmaya başladıh yardımcısı parçalama ve yıkama adımlarını otomatikleştirmek için. Biz de 2D barkod tüpleri antikor hacmi ve reaktif dağıtımın izleme otomatik tespiti büyük ölçüde sırasıyla antikorların envanter ve bizim yöntemi üzerinde kalite kontrol artıracağını öngörülüyor.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.

Materials

BD LSRFortessa BD Biosciences Flow cytometer
NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation  Beckman Coulter A31839 Laboratory Automation Workstation 
Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) Beckman Coulter 373696 Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. 
LLS kit Beckman Coulter 719262 Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing
24-Position Tube Rack Beckman Coulter 373661 Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood
BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED LabMart M111416 Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation
VisionMate High Speed 2D Barcode Reader Thermo Scientific AB-1850 2D barcode reader
8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper Thermo Scientific 4105MAT For de-capping and capping 2D barcode tubes 
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-681-335 For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation
CoolRack XT CFT24 biocision BCS-534 To hold sample tubes.
1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks Thermo Scientific 3741AMB 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies
Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL Beckman Coulter 987925 Tips for Laboratory Automation Workstation 
Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) Beckman Coulter B01091 Tips for Laboratory Automation Workstation 
Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) Beckman Coulter 394627 Tips for Laboratory Automation Workstation 
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate BD Biosciences 349202 RBC lysis
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes Fisher Scientific 14-959-5 Sample tubes
Anti-CD45 FITC BD Biosciences 347463 Effector T cell panel (base)
Anti-CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0038-42 Effector T cell panel (base)
Anti-CD4 PerCPCy5.5 BD Biosciences 341654 Effector T cell panel (base)
Anti-TCRgd BV650 BD Biosciences 564156 Effector T cell panel (base)
Anti-TCRab BV786 BD Biosciences 563825 Effector T cell panel (base)
Anti-CD8 APC-H7 BD Biosciences 560179 Effector T cell panel (base)
Anti-CCR7 PE-CF594 BD Biosciences 562381 Effector T cell panel (base)
Anti-CD45RA PE-Cy7 BD Biosciences 337167 Effector T cell panel (base)
Anti-HLA-DR BV421 BD Biosciences 562804 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD278(ICOS) PE BD Biosciences 557802 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD38 APC BD Biosciences 340439 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD279(PD1) BV421 BD Biosciences 562516 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD357(GITR) PE eBioscience 12-5875-42 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD137(41BB) APC BD Biosciences 550890 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD69 BV421 BD Biosciences 562884 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD314(NKG2D) PE BD Biosciences 557940 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD134(OX40) APC BioLegend 350008 Effector T cell panel (activation)
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper Fisher Scientific 02-689-6 For collecting blood
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade EMD Millipore 126593 For flow wash buffer
Sodium Azide Sigma-Aldrich S8032 For flow wash buffer
Heparin, sodium salt Affimetrix 16920 For flow wash buffer
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red GE Healthcare Life Sciences SH30588.02 For flow wash buffer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
  2. Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
  3. Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
  4. Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
  5. Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
  6. Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
  7. Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
  8. Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
  9. Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
  10. O’Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
  11. Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
  12. Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
  13. Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
  14. Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
  15. Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
  16. Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
  17. Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
  18. Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
  19. Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
  20. BD biosciences. . Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
  21. Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
  22. Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
  23. Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).

Tags

Antibody CocktailImmunophenotypic AnalysisPeripheral BloodSemi-automated StainingReagent DispensingPipetting Accuracy2D Barcode TubesAutomated Liquid HandlerBase CocktailActivation CocktailCross-contaminationImmunomonitoring

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Koguchi, Y., Gonzalez, I. L., Meeuwsen, T. L., Miller, W. L., Haley, D. P., Tanibata-Branham, A. N., Bahjat, K. S. A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (108), e53485, doi:10.3791/53485 (2016).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image