ヒト末梢血の免疫表現型分析のための抗体のカクテルを準備する半自動のアプローチ

このプロトコルにおける末梢血の収集と使用は、プロビデンスヘルス＆サービス治験審査委員会によって承認されました。すべての人間の被験者は、彼らの書面によるインフォームドコンセントを提供しました。 注：ユニバーサル上の注意に従ってください。すべての人間の血液は感染性およびバイオセーフティレベル2の慣行に従って処理かのように扱われるべきです。 注：末梢全血を用いて免疫表現型は、赤血球を除去するために、低張溶解、続いて細胞表面抗原を検出するための蛍光タグ化モノクローナル抗体で抗凝固処理全血をインキュベートすることによって行われます。細胞を洗浄し、試料をフローサイトメーターで分析します。本明細書に記載される方法は、2Dバーコードリーダーを搭載した自動化液体ハンドラーを用いて抗体カクテルの準備に焦点を当てています。まず、免疫細胞サブセットを識別する「ベースカクテル」とiを監視する「アクティベーションカクテル」nducible抗原は、別々に（ 表1）を調製します。その後、両方のカクテルは、「マスター抗体カクテル」を作成するために混合されます。ワークフローの図1を参照してください。 1.試料室温で保持し、その後、ヘパリンナトリウム抗凝固処理血液収集チューブ内の静脈穿刺を介して末梢血を収集し、適切な混合を確実にするために穏やかに数回反転させ、そして。凝固または13溶血場合は、検体を拒否します。 2.実験器​​具の準備ラベル2Dバーコードの人間が読み取り可能なラベル付きチューブ（抗体名、ベンダー、カタログ番号、ロット番号）。 2次元バーコード管を対応する（ 表1に記載されている）ベンダーからの抗体のバイアルの内容全体を転送します。 注：誤って試薬の次善の転送につながる液面検知（LLS）をトリガ気泡として気泡を導入しないように、細心の注意を払ってください。 注：することを確認し、各抗体のviアルは、実行のために十分な抗体を持っています。 2次元バーコードリーダーにより各チューブのための2次元バーコードを読み取ります。 表計算ソフトを用いて抗体名前（AB）とバーコードの読み取りを含むスプレッドシート（BC）を作成し、「AB_BC.csv」（ 表2）のようにカンマで区切られた値（CSV）ファイルを、それを保存します。 注：任意の（ 例えば 、0163562544）場合は、バーコード番号の最初の「0」を維持するために、「テキスト」ではない「番号」としてセルの書式を設定することを確認します。データの終わりを指定するには、末尾に "X、0000000000"を追加します。 自動液体ハンドラでデッキのフレームにネジLLS金属プレートはLLSを有効にします。 自動液体ハンドラー3.プログラミング注：2つの方法が自動液体ハンドラー用のソフトウェアでプログラムされます：「ベースのカクテル」および3.1の「アクティベーションカクテル」）を作るためのa）の方法、および「マスターAntiboを作るためのb）の方法ベースのカクテル」と「3.2におけるアクティベーションカクテル」）（ 図1）」を組み合わせることにより、「DYカクテル。 「ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」（ 図2）を作成するためのメソッドを作成します。 表 ：P50チップ（BASE_CT_P50と「ベースカクテル"のためのマイクロリットル中の抗体名（AB_NAME）、先管場所（WELL-BASEまたはWELL-ACT）、およびボリューム（VOL）のための情報を持っているスプレッドシートを作成、表計算ソフトを使用して、 3）またはP200のヒント（BASE_CT_P200： 表4）とP50チップ（ACT_CT_P50で「アクティベーションカクテル"： 表5）またはP200のヒント（ACT_CT_P200： 表6）。 CSVファイルとして保存します。 「WELL-BASE」と「WELL-ACT「位置については、 図3の番号を参照してください。 注：VOL =力価X（染色+ 2の＃）μlの。 表1の力価がたくさん固有のものです。オペレータは、報復を決定する必要があります各抗体のためのER他人14によって記載されているように。 「ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」を作るための方法を作成するために、コンピュータに自動液体ハンドラー用のソフトウェアを起動するアイコンをクリックします。 注：以下の手順を3.1.3-3.1.7ラボウェアを定義します：2次元バーコード管（ 図4）を有する管ラックを。測定は、参照として提供されます。研究者らは決定し、各楽器のために調整する必要があります。 「プロジェクト」の下のツールバーで、「実験器具タイプ・エディター」を選択します。 「コピー」を選択し、96ウェル平板のオブジェクトを右クリックし、ポップアップウィンドウで「Matrix_OneML_TubeRack」と入力します。 ダイアログボックスを開くには、オブジェクト「Matrix_OneML_TubeRack」をダブルクリックします。ハイライト「基本情報」は、「スパン」と「高さ」のための4.625センチメートルための12.775センチメートル（X）と8.546センチメートル（Y）を設定します。 （ 図4A）。 次に、ハイライト」MOVEM"その後。セットグリッパーは、0（Y）を0（X）をオフセット、および0.3（Z）、グリッパーは-0.1cmスクイズ、グリッパーUnsqueeze 2.6センチメートル、制限速度75％、およびチェック「ENT情報」グリッパーセンサーを使用します（ 図図4（b））。 そして、「Well_1」を強調表示します。以下のように設定します。「まあオフセット」。 1.5センチメートル（X）および1.13センチメートル（Y）、「まあカウント」。 12（X）及び8（Y）、「まあ間隔」。 0.9（X）および0.9（Y）、「最大音量」。 1500μlを、フォーマット";レギュラー、「オフセットコラム2"; 0、および「デフォルトのボリューム"; 0（ 図4C）。 最後に、「まあ設定」（ 図4C）の右にある「編集…」ボタンを押してください。以下のようなポップアップウィンドウで、設定：「シェイプ」。ラウンド、「アッパー半径」。 0.37センチメートル、「低級半径」。 0.37 cmであり、「高さ」。 3.9センチメートル。 「底部分」と設定された「シェイプ」を確認してください。コー​​ン、「半径」。 0.37 cmであり、「高さ」。 0.4センチメートル（ 図4D）。注：マイクロチューブとチューブのラック：次の手順は3.1.8-3.1.11実験器具を定義します。測定は、参照として提供されます。研究者らは決定し、各楽器のために調整する必要があります。 「プロジェクト」の下のツールバーで、「実験器具タイプ・エディター」を選択します。 、24位のラックのオブジェクトを右クリックして「コピー」を選択し、「SmallTuberack_microfugetubes」と入力します。 ダイアログボックスを開くには、オブジェクト「SmallTuberack_microfugetubes」をダブルクリックします。ハイライト「基本情報」は、「スパン」と「高さ」のための3.95センチメートルための12.75センチメートル（X）および8.5センチメートル（Y）を設定します。 次に、「Well_1」を強調表示します。以下のように設定します。「まあオフセット」。 1.621センチメートル（X）と1.181センチメートル（Y）、「まあカウント」。 6（X）と4（Y）、「まあ間隔」。 1.9（X）および1.9（Y）、「最大音量」。千μlを、フォーマット ";レギュラー、「オフセットコラム2"; 0、および「デフォルトのボリューム "; 0。 最後に、プレス「まあ設定」の右にある「編集…」ボタンをクリックします。以下のようなポップアップウィンドウで、設定：「シェイプ」。ラウンド、「アッパー半径」。 0.3345センチメートル、「低級半径」。 0.274 cmであり、「高さ」。 3.6728センチメートル。 「底部分」と設定された「シェイプ」を確認してください。半球、および「半径」。 0.1575センチメートル。 注：以下の手順は3.1.12-3.1.35」ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」（ 図2）を作るための「新規メソッド」をプログラムする方法を説明します。 「新規メソッド」アイコン、[開く]をクリックします。 新しい方法で「開始」と「終了」アイコン（ 図2）との間で「IF」のアイコンをドラッグします。 「IF」アイコンをクリックして強調表示します。条件のために次のように入力します。のCreateObject（ "World.EngineObject"）シミュレートします。 注：これはエラーチェックを行ってからソフトウェアを防止し、動作するように、この方法が有効になります。このステップがなければ、S3.1.20で説明）：バーコードはステップ」バーコードを読み取りVisionMate」の後にのみ使用可能です読み込むようoftwareは、データセットのために不足している情報に警告します。このステップは、ソフトウェアで検証ステップを無効にしているので、オペレータは、この方法を実行するためのデッキ上に十分なヒントや試薬があります確認する必要があります。 「その後」のアイコンと「IF」アイコン（ 図2）の下のアイコンを「終了」最初の間の「装置のセットアップ」アイコンを挿入します。 注：以下のすべての手順については、「エルス」アイコンと「IF」のアイコンの下の2番目の「終了」アイコン間のドラッグ・アイコンは、手順は、「エルス」にカプセル化されるように。 この方法で「エルス」アイコン（ 図2）の下に、「装置のセットアップ」アイコンをドラッグします。 ウィンドウを開くための方法で、「装置のセットアップ」アイコンをクリックします。 P50 LLSフィルタリングヒントのアイコンをドラッグしてlabwaresを設定し、P200 LLSフィルタリングヒント、P1アイコンリストから対応するデッキ位置に000のヒント、「Matrix_OneML_TubeRack "、2" SmallTuberack_microfugetubes」、及びリザーバ。 「AB_BOX "として" Matrix_OneML_TubeRack」と名のダイアログボックスを開きます。ベースカクテルとアクティベーションカクテルのための「ACT_CT」などの他のための「BASE_CT」（図5）のように「SmallTuberack_microfugetubes」のためのダイアログボックスを開き、名前1。 「ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル"のためのマイクロチューブにリザーバからバッファを転送するためのステップを追加する方法（ 図2）に「転送」アイコンをドラッグします。 「アクティベーションカクテル "のための"ベースのカクテル "と= 25μlのX（2を染色＃）の転送容量= 25μlのX（2を染色＃）。 2次元バーコードリーダーの上に「Matrix_OneML_TubeRack」を移動するための手順を追加します。 （メソッドにFiが 「VisionMate移動」アイコンをドラッグしますグレ2）と甲板上のバーコードリーダーの位置に初期デッキ位置からの移動を指定します。 「VisionMateを：バーコード読み取り」にドラッグする方法（ 図2）にアイコンを。ダイアログボックスを開き、デバイスとして「VisionMate "を選択し、「BC_Read」として設定データに名前を付けます。 「ユーザーの一時停止」（ 図2）をドラッグして、「システム全体を一時停止し、このメッセージを表示する」と次のステップに進む前に、すべてのバーコードが読み取られることを確認するユーザーを思い出させるためにフィールドにコメントを入力]を選択します。 注：以下の手順3.1.22-3.1.26はよく場所やバーコード情報を用いて抗体名の間にリンクされます。これは、抗体名「AB」に基づいて、特定の抗体の場所を見つけるために、自動液体ハンドラを有効にします。 方法（ 図2）に「報告手順」のアイコンをドラッグします。 テキストプログラムを使ってテキストフ​​ァイルを作成し、それを保存コンピュータ上のドキュメントフォルダ内の「BC_Readout」など。 「レポートステップ」用のダイアログボックスを開き、レポートスタイルのための「テキストフ​​ァイル」を選択し、ブラウジングを通じて「BC_Readout」ファイルを選択します。 注：3.1.16に設定され得られた「BC_Readout」ファイルは、バーコードの情報を含むヒントを除く甲板上のすべてのlabwaresの情報が含まれています2次元バーコードチューブと「Matrix_OneML_TubeRack」の井戸の位置については、読み取ります。 バーコードとよく情報をリンクするための「データ・セットの作成」ステップを追加します。メソッドに「作成データセット」のアイコンをドラッグします（ 図2）、「ファイルから読み込み」を選択し、「AB_BC.csv」を選択し、ダイアログボックスを開くには、それをクリックします（2.4で作成した表2）、「カンマをチェック区切り記号付き」と「ファイル」は、ヘッダ行を持っています。 注：ファイルのプレビューウィンドウでは、抗体名前（AB）とバーコードが見られるべきである（BC）を読み出します。 S IN、スタックの深さのための実験器具の場所と "0"のために「VM1」を選択し、3.1.25で「データ・セットの作成」」のサンプルIDを一致させる」を選択し、データと一致するフィールド「BC」を使用するための雨ダイアログボックス「BC_Read」に設定します。 「AB」と「データを作成する設定」の「BC」（ 図6）を選択します。 方法（ 図2）に「VisionMate移動」アイコンをドラッグして、バックデッキの初期デッキ位置にバーコードリーダの位置「VM1」からの移動を指定します。 注：以下の手順は3.1.28-3.1.33」ベースのカクテル」用の転写工程を定義します。 「ワークリスト」アイコン（ 図2）をドラッグして、3.1.1で作成したワークリストファイル"Base_CT_P50」（ 表3）を参照して選択します。 「ループ全体のワークリスト」を確認してください。 「ワークリスト」アイコンの下に直接「転送」アイコンをドラッグします（ 図2）。</李> 仕様・フィールドを開き、「転送」アイコンをクリックします。ちょうど1のプローブのを選択し、ヒントをフィルタリングP50のLLS、転送が行われたときに、「それらをアンロード」、および「転送間のヒントを変更する」にチェックを選択します。名前「AB_BOX "によってデッキで、「ソースを追加するには、ここをクリックしてください"をクリックして、ソースを追加実験器具として「Matrix_OneML_TubeRack」を選択し、選択した場所。 右クリックして「転送」のための指定フィールド、96ウエルの図の「ズームイン」で、すぐに「使用データセット」の後に「AB」を選択し、その値はと "= AB_NAME" "等しい"場所を選択。選択肢の転写技術を選択します。 注：LLSの使用は非常に底部付近に沈殿した破片を避けることをお勧めします。 「転送」、クリックして選択宛先の指定欄で「送信先を追加するには、ここをクリックしてください」、右にズームする]をクリックし、「SmallTuberack_を選択= VOL」、と名前で甲板上の場所「BASE_CT」実験機器、などのボリュームとして「microfugetubes」。ズームアウトした後、再び右クリックしてチェック「テキストとして選択の指定」をチェックし「発現を持つターゲットを指定しますが、下記の宛先デッキ位置のための変数として "とタイプ" = WELL_BASE "。 その後P200 LLSフィルタリングのヒントを選ぶだけでなく、P200 LLSフィルタリングのヒントのための適切なピペット技術「Base_CT_P200を「csvファイルを選択することにより、P200のヒントと「ベースカクテル」、（ 表4）についても同様3.1.29-3.1.32を繰り返します。 注：以下の手順3.1.34および3.1.35「アクティベーションカクテル」用の転写工程を定義します。 csvファイル"ACT_CT_P50」（ 表5）を選択し、送信先として「ACT_CT」を選択することにより、P50のヒントと「アクティベーションカクテル」についても同様3.1.29-3.1.32を繰り返します。右先をクリックし、「テキストとして選択を指定する」にチェック;。チェック "以下の式でターゲットを指定します」と先の位置のための変数として、「= WELL_ACT」と入力します。 csvファイル"ACT_CT_P200」（ 表6）とP200 LLSフィルタリングのヒントを選択することにより、同様にP200のヒントと「アクティベーションカクテル」の3.1.34を繰り返します。 注：「ベースカクテル」および「活性化カクテル」を作製するための方法は、保存後に閉じることができます。 5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブ（ 図7）に「ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」を組み合わせることにより、「マスター抗体カクテル」を作るための新しい方法を作成します。 注：5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブとチューブのラック：次の手順は、3.2.1-3.2.6実験器具を定義します。数字は参考のために提供されています。研究者らは決定し、楽器のために調整する必要があります。 「プロジェクト」の下のツールバーで、「実験器具タイプ・エディター」を選択します。右のcl24位のラックのオブジェクトに嫌なは、「コピー」を選択し、ポップアップウィンドウで「BiocisionCoolRack_XT」と入力します。 ダイアログボックスを開くには、オブジェクト「BiocisionCoolRack_XT」をダブルクリックします。 ハイライト「基本情報」は、「スパン」と「高さ」のための7.93センチメートルための12.78センチメートル（X）および8.57センチメートル（Y）を設定します。 「Well_1」を強調表示します。以下のように設定します。「まあオフセット」。 1.55センチメートル（X）および1.33センチメートル（Y）、「まあカウント」。 6（X）と4（Y）、「まあ間隔」。 1.95（X）および1.97（Y）、「最大音量」。 2000μlで、フォーマット ";レギュラー、「オフセットコラム2"; 0、および「デフォルトのボリューム "; 0。 編集する「まあ設定」を開きます。 「シェイプ」;以下のように設定しますラウンド、「アッパー半径」。 0.5375センチメートル、「低級半径」。 0.48 cmであり、「高さ」。 7.07センチメートル。 「底部分」と設定された「シェイプ」を確認してください。半球、および「半径」。 0.45センチメートル。 注：次の手順3.2.6-3.2.7は、転送手順を定義し、ステップ3.2.14で使用されます。 次のヘッダーを有する抗体カクテルを作るためのcsvファイル"AB_MACT」（ 表7）を作成します。a）「SRC_BASE」。 「ベースのカクテル」、b）の「WELL_BASE」のための実験機器名。よく「ベースカクテル "のための実験機器内の場所は、c）の「VOL_BASE」。 μL、d）の「SRC_ACT」の「ベースカクテル "のための転送量。 「アクティベーションカクテル」、e）の「WELL_ACT」のための実験機器名。よく「アクティベーションカクテル」、f）は「VOL_ACT」のための実験機器内の場所。 μlの中で「アクティベーションカクテル」、g）の「DEST_MACT」のための転送量。 「マスター抗体カクテル "のデッキ位置情報、及びh）「WELL_MACT」。よく「マスター抗体カクテル」用のチューブラック内の情報を配置します。 以下のように（ 表7））3.2.6で作成したヘッダーの下に情報を記入します。a）「BASE_CT」を使用図3（a）に示すように、「WELL_BASE」のためのSRC_BASE下、b）はリストウェル位置情報、c）の抗体のリスト全体積（「VOL_BASE」の下で、単一の染色のためのすべてのベース抗体価）のバッファ+合計25μlの、D）を使用します図3B、抗体のF）リスト合計体積（「VOL_ACT」の下で、単一の染色のために、すべての活性化抗体価）のバッファ+合計25μlのに示すように、「WELL_BASE」のためのSRC_ACT、e）のリストも位置情報に基づく「ACT_CT」。転送T細胞FM3用バッファ25μlの。 図8に示すように、「WELL_MACT」の「DEST_MACT」の「SPL_TUBES_1」（3.2.10を参照）、およびh）リストウェル位置情報を使用してテスト1-3、g）について、表1を参照してください 。 注：以下の手順は3.2.8-3.2.15「マスター抗体カクテル」を作るための方法をプログラムします新しい方法（ 図7）を開きます。 「命令バイトをドラッグします新しいメソッドにument設定」アイコン（ 図7）。 デッキダイアグラム上に「装置のセットアップ」P1000のヒントについては、ドラッグ・アイコン、2「SmallTuberack_microfugetubes」、および「BiocisionCoolRack_XT」の指定フィールドで。 3.1.17で指定されるように、それぞれ、「BASE_CT」と「ACT_CT」として2」SmallTuberack_microfugetubes」と名のダイアログボックスを開きます。 （ 図9）3.2.7で指定されているように、「SPL_TUBES_1」として「BiocisionCoolRack_XT」のためのダイアログボックスを開き、名前。 方法（ 図7）に「グループ」アイコンをドラッグして、新しい「グループ」を追加します。 「マスター抗体カクテル」（ 図7）を作るための「ベースのカクテルを「転送する「グループ」アイコンの下に直接「転送ファイルから"アイコンをドラッグします。 「ファイルからの転送 "の仕様フィールドで、使用中のP1000のヒントを選択し、S転送が行われたときに、「それらをアンロード」、および「転送間のヒントを変更する」にチェックを選びます。 「ファイルからの転送"の仕様フィールドで、ファイルを選択し、「AB_MACT」（ 表7）ブラウジングによって、チェック"ファイルは、ヘッダー行を持っています」。ソース実験器具でも情報源の実験器具の位置と「WELL_BASE」の「SRC_BASE」を選択し、先の実験器具と宛先実験器具ではよく情報については、「WELL_MACT」の「DEST_MACT」を選択し、ボリュームについては、「VOL_BASE」を選択します（図10）。 P1000のヒントのための適切な転写技術を選択しました。 注：LLSは、このプロセスのために必要ではないかもしれません。 「マスター抗体カクテル」を作るための「ベースカクテル」（ 図7 <と混合される、「アクティベーションカクテル」を転送するために「グループ」のすぐ下にドラッグして別の「ファイルからの転送」を追加/強いです>）。同様に3.2.13と3.2.14のように転写工程を設定します。例外は次のとおりです。a）のソース実験器具の位置、b）はソース実験器具ではよく情報については、「WELL_ACT」、およびc）ボリュームについては、「VOL_ACT」の「SRC_ACT」を選択します。 4.操作手順まず、コンピュータ上の2次元バーコードリーダーを起動するためのソフトウェアのアイコンをダブルクリックします。 次に、コンピュータに自動液体ハンドラを起動するためのソフトウェアのアイコンをダブルクリックします。 「インストゥルメント」の下で、自動液体ハンドラーのプライムシリンジに「ホームすべての軸」を​​選択します。すべての注射器は可視気泡を含んでいないことを確認してください。 注：「ホームすべての軸は「また楽器にその後の動きを作るための基準点を与えます。 A用のソフトウェアで「ベースカクテル」と「アクティベーションカクテル」（ 図2）を製造するための方法を開きます。utomated液体ハンドラー。 「BASE_CT」と作られている「ベースカクテル」と「アクティベーションカクテル」の数に応じて「ACT_CT」の「SmallTuberack_microfugetubes」（ 図3）にマイクロチューブを置きます。そして、「装置のセットアップ」（ 図5）によると、デッキの上に置きます。 「装置のセットアップ」に従って、デッキに緩衝液で貯蔵器を置きます。 脱キャップ8チャンネルスクリューキャップデキャッパを用いて抗体を含む2次元バーコードチューブ。交差汚染を避けるために、キャップ保持トレイ上の正確な順序でキャップをしてください。 「装置のセットアップ」（ 図5）によると、デッキの「Matrix_OneML_TubeRack」を配置します。 「装置のセットアップ」（ 図5）によると、デッキの上に置いてP50のLLSフィルタリングヒント、P200 LLSフィルタリングヒント、およびP1000のヒント。 グリーントライをクリックして、メソッドを起動します。角状のスタートアイコン。ポップアップウィンドウが表示ように、この方法で定義された甲板上のすべての項目が「装置のセットアップ」に一致していることを確認します。これはポッドおよび/またはグリッパーをつぶす可能性があるので、デッキの「装置のセットアップ」に記載されていない物を置かないでください。続行するには「OK」を押します。 「Matrix_OneML_TubeRackが「2Dバーコードリーダー上に移動され、バーコードが読み取られた後、別のポップアップウィンドウは、すべてのバーコードを読み取るかどうかを尋ねます。確認したら「OK」を押すと進みます。 自動液体ハンドラーによる転送が完了すると、8チャンネルのスクリューキャップデキャッパを使用して、2次元バーコードのチューブをおさらいし、バック4°Cにそれらを置きます。 渦すべてのマイクロチューブを激しく20秒間、およびチューブのラックにそれらを返します。 注意：不十分なボルテックスは、細胞の次善の染色をもたらす可能性があります。 「ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」を作るための方法を閉じます。そして、「マスター抗体カクテル」を作るための方法を開きます。 「BiocisionCoolRack_XT」（ 図8）で予め標識5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブを設定し、デッキの上に置きます。ラベルは、どのような "ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」混合されるだけでなく、適切な患者IDを示す必要があります。 「ベースのカクテル」、「アクティベーションカクテル」、およびデッキのP1000のヒントのための場所チューブラック（ 図9）。方法（ 図7）を起動します。ポップアップウィンドウの指示に従い、必ずこの方法でデッキ一致インストゥルメンタルセットアップ上の項目（ 図9）ことを確認してください。続行するには「OK」を押します。 上記のプロセスが完了したら、手動で抗体カクテルを含む各5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブに血液検体の50μlを添加します。 クラスII生物学的安全キャビネット内の渦のサンプル管とは、暗所で室温で15分間インキュベートします。タークこれは矛盾した染色になりますように、チューブの側面に血液をストリーキング回避する電子ケア。慎重に流れ、洗浄緩衝液で湿らせた綿棒によって血液の任意のスジを除去します。 RBC溶解緩衝液1mlを手動で追加し、暗所で室温で15分間インキュベートします。 400×gで5分間のフロー洗浄緩衝液（0.1％アジ化ナトリウム、1％BSA、1×HBSS中で10 U / mlのヘパリン）及び遠心分離機を2mlを加えます。クラスII生物学的安全キャビネット内上清を捨てます。この洗浄工程を繰り返します。再懸濁フローの洗浄緩衝液0.5ミリリットルで染色された細胞。 設定することをフローサイトメーターは、小麦粉レーザと適切なフィルター、および5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブを使用して実行標本が装備されています。データ収集12,15のための標準的なサイトメーターのキャリブレーションおよび蛍光補正方法を使用します。 表1に「フルオロフォア」に記載されているすべてのパラメータを収集します。 注：適切な制御材料は、適切なお尻を確保するために、各実行で使用する必要がありますAYパフォーマンス。 サンプルを実行した後、エクスポートがFCSファイルとしてデータを取得しました。 適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。ヒト免疫プロジェクト1で概説ゲート戦略を使用して、T細胞サブセットを識別します。