Un approccio semi-automatico di preparare anticorpi cocktail per l'analisi immunofenotipica di Human sangue periferico
Summary
Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Abstract
Immunofenotipizzazione di sangue periferico da flusso determina citometria a cambiamenti dello stato di frequenza e l'attivazione dei leucociti periferici durante la malattia e il trattamento. Essa ha il potenziale per prevedere l'efficacia terapeutica e di identificare nuovi target terapeutici. Tutta la colorazione del sangue utilizza il sangue non manipolata, che riduce al minimo gli artefatti che possono verificarsi durante la preparazione del campione. Tuttavia, tutta la colorazione sangue deve essere fatto sul sangue raccolto di recente per garantire l'integrità del campione. Inoltre, è meglio preparare un cocktail di anticorpi nello stesso giorno per evitare la potenziale instabilità del tandem-coloranti e prevenire l'interazione tra reagenti coloranti viola brillanti. Pertanto, tutta macchie di sangue richiede un'attenta standardizzazione per il controllo di variabilità intra ed inter-sperimentale.
Qui riportiamo dispiegamento di un gestore di liquido automatizzato dotato di (2D) lettore di codice a barre bidimensionale in un processo standard di rendere gli anticorpicocktail Y per citometria a flusso. Anticorpi sono stati trasferiti in provette 2D codice a barre disposte in un formato a 96 pozzetti e il loro contenuto compilato in un database. Il gestore liquido potrebbe quindi individuare le fiale di anticorpi fonte facendo riferimento a nomi di anticorpi all'interno del database. Il nostro metodo eliminato coordinamento noioso per il posizionamento di tubi di anticorpi di origine. Ha fornito versatilità che consente all'utente di cambiare facilmente qualsiasi numero di dati nel processo di erogazione di anticorpi come anticorpo specifico da usare, il volume e la destinazione modificando il database senza riscrivere scripting nel metodo software per ciascun test.
Un proof of concept esperimento ha raggiunto una precisione eccezionale saggio inter e intra, dimostrano la preparazione replica di un 11-colore, il flusso 17-anticorpo citometria a test. Queste metodologie sono aumentate throughput complessivo di citometria a flusso saggi e facilitato la preparazione quotidiana delle complesse cocktail di anticorpi necessari per il feno dettagliatacaratterizzazione typic di sangue periferico non coagulato appena raccolti.
Introduction
Immunofenotipizzazione di sangue periferico umano determina cambiamenti quantitativi e qualitativi in sottoinsiemi di cellule immunitarie 1. Esso permette di comprendere meglio i meccanismi di azione e di resistenza, la scoperta di biomarcatori predittivi aiuti, e facilita lo sviluppo di immunoterapie combinazione. Pertanto, la convalida e la standardizzazione di immunofenotipizzazione è una zona di notevole interesse per i ricercatori accademici, laboratori clinici, e le industrie.
Anche se immunofenotipizzazione di sangue periferico con metodi citometria di flusso è attualmente utilizzato per la gestione clinica delle neoplasie ematologiche 2,3 e virus dell'immunodeficienza umana (HIV) 4,5, immunofenotipizzazione affidabile di sangue periferico per le richieste di immunoterapia considerazioni specifiche per la convalida e la standardizzazione perché richiede una più ampia copertura su sottoinsiemi di cellule del sistema immunitario e l'attivazione / recettori inibitori 1,6-8. succeimmunofenotipizzazione ssful richiede un'attenta standardizzazione per ridurre al minimo esperimento-to-esperimento variabilità legate alla configurazione dello strumento e la procedura di colorazione delle cellule 9,10. Mentre la standardizzazione delle impostazioni dello strumento per la citometria di flusso è ben definito per affrontare il primo problema 9,11,12, non è ancora chiaro come ridurre al minimo la variabilità legate alla colorazione delle cellule senza limitare la copertura di sottoinsiemi di cellule immunitarie e il loro stato di attivazione.
Poiché il numero di antigeni da rilevare aumenta, così fa anche la possibilità di errore e variabilità causa ottimale erogazione di reagente e la contaminazione incrociata. Metodi per l'analisi phenoptypic di sangue intero anticoagulato sono stati stabiliti alla fine del 1980 per l'uso in test di laboratorio clinico. Questi stessi metodi servono le esigenze del laboratorio di ricerca per la preparazione del campione. Soprattutto, i cocktail di anticorpi utilizzati nel laboratorio clinico sono tipicamente meno complesse e avaOTTIMIZZARE LE OPPORTUNITÀ pre-titolato e pre-miscelato dal produttore. È necessario solo un unico trasferimento del cocktail di anticorpi pre-miscelato. Nell'impostazione di ricerca, cocktail di anticorpi di 10-16 anticorpi sono tipici. Ogni cocktail deve essere convalidato per la stabilità dal laboratorio o preparato fresco prima di ogni test. Preparazione più cocktail di anticorpi per un campione potrebbe comportare la dispensazione di 50-80 singoli anticorpi, un compito che è sia noioso e soggetto a errori.
Automazione di preparazione di cocktail ha diversi vantaggi rispetto preparazione di cocktail manuale come il minor numero di errori, una maggiore precisione di pipettaggio, e forse anche diminuito gli sprechi di reagente. Qui, si segnala il successo di un gestore di liquido automatizzato dotato di un (2D) lettore di codice a barre bidimensionale nel processo di cella-colorazione immunofenotipizzazione per ridurre al minimo la variabilità legate alla preparazione del campione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunofenotipizzazione di sangue periferico è di fondamentale importanza per ottenere intuizioni risposte individuali a immunoterapia. La sfida consiste nel test di standardizzazione per controllare esperimento-to-esperimento variabilità 1,14. Una fonte di variabilità risiede nella manipolazione umana di campioni. Pertanto, è concepibile che l'automazione parziale o totale del campione di trasformazione faciliterà una drastica riduzione esperimento a esperimento variabilità 1,14. In questo protocollo, riportiamo il nostro sforzo di successo per ridurre al minimo la variabilità del test con l'introduzione di un gestore di liquido automatizzato dotato di lettore di codici a barre 2D per la colorazione del campione in tutto immunofenotipizzazione sangue.
Nel disegno, il nostro metodo è versatile e può monitorare altri sottoinsiemi immuni con l'aggiunta di ulteriori "Cocktails base" per definirli. Tali sottogruppi includono cellule T helper, le cellule T regolatorie, cellule B, le cellule NK, cellule dendritiche, monociti e (manoscritto inpreparazione) 18. Abbiamo adattato i pannelli di anticorpi raccomandati del consorzio con l'introduzione di ulteriori marcatori 1. popolazioni cellulari sono stati identificati utilizzando "Cocktail Base" coniugato con fluorocromi con emissione minimo nella brillante viola 421 (BV421), ficoeritrina (PE), e allophycocyanin (APC) rilevatori, come abbiamo voluto riservare questi canali per il rilevamento di antigeni inducibile. Questa funzione non solo garantisce la sensibilità più alta per monitorare lo stato di attivazione delle cellule del sistema immunitario, ma consente anche una sistemazione flessibile di nuovi marcatori di attivazione come questi tre fluorocromi sono più frequentemente coniugati con anticorpi contro marcatori inducibile. Pertanto, il nostro metodo non è adatto solo per la preparazione di cocktail per tutta la immunofenotipizzazione sangue, ma è utile anche per la colorazione altri campioni, tra cui cellule mononucleari del sangue periferico e le cellule recuperate dai tessuti disaggregati (ad esempio, tumori).
intro di successoproduzione del nostro metodo richiede una particolare attenzione ai passi in preparazione labware e programmazione ed esecuzione del metodo. Preparazione dei tubi di codici a barre 2D comprende l'etichettatura con etichette leggibili e il trasferimento degli anticorpi ai tubi designati. Per evitare l'introduzione di errori, si consiglia di fare questo con due persone. Ogni volta che cambia i fogli di calcolo, gli investigatori dovrebbero verificare se il metodo funziona correttamente. La scelta di adeguati metodi di dispensazione durante la programmazione assicura il trasferimento del liquido di successo. LLS consente pipettaggio senza ottenere detriti precipitati dal fondo dei tubi di anticorpi, per il quale usiamo o P50 o suggerimenti conduttivi P200. LLS non può essere una buona opzione per le punte P1000 come LLS è più sensibile con punte P1000 e, a volte falsamente innescato da presenza di bolle. Heights di definizione da laboratorio devono essere regolati per ogni strumento potrebbe verificarsi come non ottimale trasferimento di liquidi, ad esempio, se non c'è abbastanza spazio tra il bordo di puntee il fondo dei tubi. Come mostrato in Figura 12, se il "cocktail Base" e / o "Attivazione cocktail" non sono in agitazione bene, può causare macchie subottimale.
Abbiamo pensato di usare i reagenti liofilizzati per la colorazione delle cellule come un approccio alternativo per ridurre la variabilità connessi con il reagente di erogazione 19. Tuttavia, coniugati polimerici di coloranti viola brillanti sono noti per interagire gli uni con gli altri segnali non specifici che causano. Come tale, l'aggiunta di più di due coniugati polimerici (ad esempio, BV421 e BV650 etc.) in reagenti liofilizzati possono provocare la segnalazione non specifico (ad esempio, l'aumento del segnale BV650 sfondo in BV421 + popolazione) 20. Inoltre, i reagenti liofilizzati mancano di flessibilità per l'inclusione nuova colorazione. Essi sono di solito più costosi e richiedono un ordine all'ingrosso. Per queste ragioni, abbiamo scelto di utilizzare il gestore liquido automatizzato dotato di tubi di codici a barre 2D. Anche se tfiocchi tempo per impostare e comporta un investimento iniziale per l'acquisto dello strumento, a lungo andare questi fattori saranno compensate da un aumento della produttività e la riproducibilità dei saggi. In effetti, alcuni gruppi precedentemente segnalato il successo dell'integrazione del gestore liquido automatizzato nel flusso di lavoro di immunofenotipizzazione o applicazioni simili 21,22. soluzioni automatizzate per l'analisi di citometria a flusso sono disponibili da fonti commerciali (FACS SPA III, Automated cocktail Preparazione Workstation, e FlowStainer) anche. Questo indica inoltre vi è un grande bisogno per la preparazione di cocktail automatizzata per immunofenotipizzazione.
Dopo aver imparato questa tecnica, prevediamo che lo sviluppo di completamente automatizzato immunofenotipizzazione sangue intero ridurrà ulteriormente la variabilità esperimento a esperimento e potrebbe fare tutta la immunofenotipizzazione sangue realizzabile anche in un ambiente 23 trial clinico multicentrico. Abbiamo già iniziato a utilizzare un lyse erah assistente per automatizzare le fasi di lisi e lavaggio. Prevediamo inoltre che la determinazione automatica del volume di anticorpo nei tubi di codici a barre 2D e l'inseguimento di erogazione del reagente migliorerà notevolmente l'inventario di anticorpi ed il controllo di qualità nostro metodo, rispettivamente.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
Materials
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
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