גישה אוטומטית-למחצה הכנת קוקטיילי נוגדן עבור ניתוח Immunophenotypic של אדם דם היקפי
Summary
Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Abstract
Immunophenotyping של דם היקפי ידי זרימת cytometry קובע שינויים במעמדם תדירות הפעלה של לויקוציטים היקפי במהלך מחלה וטיפול. יש לו את הפוטנציאל לחזות יעילות טיפולית ולזהות מטרות טיפוליות חדשניות. מכתים הדם כולו מנצל דם unmanipulated, אשר ממזער ממצאים שיכולים להתרחש במהלך הכנת המדגם. עם זאת, מכתים דם כולה צריך להיעשות גם על דם טרי שנאסף כדי להבטיח את תקינותו של מדגם. בנוסף, עדיף להכין קוקטיילים נוגדן באותו יום, כדי למנוע אי-יציבות אפשרית של טנדם צבעי ולמנוע אינטראקציה מגיב בין צבעי סגול מבריק. לכן, מכתים דם שלם דורש סטנדרטיזציה זהיר כדי לשלוט על השתנות תוך והבין-ניסיוני.
כאן אנו מדווחים הפריסה של המטפל נוזלי אוטומטי מצויד בקורא ברקוד דו מימדי (2D) לתהליך רמת ביצוע antibodקוקטיילים y עבור cytometry הזרימה. נוגדנים הועברו לתוך צינורות המינימרקטים 2D מסודרים בתבנית 96 באר ותוכנם הידור במסד נתונים. המטפל הנוזל יוכל לאתר את בקבוקוני נוגדן המקור על ידי הפנית שמות נוגדנים בתוך מסד נתונים. השיטה שלנו בוטלה תיאום משעמם מיצוב של צינורות נוגדן המקור. היא ספקתי צדדית המאפשרת למשתמש לשנות כל מספר בקלות פרטים בתהליך מחלק הנוגדנים כגון נוגדנים ספציפיים לשימוש, נפח, ויעד על ידי שינוי בבסיס הנתונים בלי לשכתב את scripting בשיטת התוכנה עבור כל assay.
הוכחת ניסוי מושג מושגת דיוק assay יתר משפחות ובתוכן מצטיין, שמפגין הכנה לשכפל של 11 צבעים, תזרים 17-נוגדן cytometry assay. מתודולוגיות אלה הגדילו את תפוקה הכוללת זרימה cytometry מבחנים ובהנחייה כנה יומית של קוקטיילי נוגדן המורכבים הנדרשים עבור pheno המפורטאפיון typic של דם היקפי anticoagulated הטרי שנאסף.
Introduction
Immunophenotyping של דם היקפי אדם קובע שינויים הכמותיים ואיכותי תת תא חיסון 1. הוא מספק תובנה מנגנוני פעולה והתנגדות, עזרי גילוי סמנים חזויים, ומקל על הפיתוח של immunotherapies שילוב. לכן, אימות וסטנדרטיזציה של immunophenotyping הוא שטח של עניין רב חוקרי אקדמיה, מעבדות קליניות, ותעשיות.
למרות immunophenotyping של דם היקפיים בשיטות תזרים cytometric משמש כיום לניהול הקליני של ממאירויות המטולוגיות 2,3 ו וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) זיהום 4,5, immunophenotyping אמין של דם היקפיים עבור דרישות אימונותרפיה שיקולים ספציפיים אימות וסטנדרטיזציה כי זה דורש כיסוי נרחב יותר על תת תא החיסון והפעלה / קולטנים מעכבות 1,6-8. succeimmunophenotyping ssful דורש סטנדרטיזציה משתדל למעט השתנות ניסוי ל-ניסוי הקשורים התקנה מכשירה ואת 9,10 הליך מכתים התא. בעוד סטנדרטיזציה של גדרות מכשירות עבור cytometry זרימה היא מבוססת היטב כדי לענות על החשש לשעבר 9,11,12, עדיין לא ברורים כיצד למזער השתנות הקשורות תא מכתים ללא הגבלת סיקור של תת תא חיסון מצב ההפעלה שלהם.
ככל שמספר אנטיגנים כדי להתגלות עליות, כך גם את ההזדמנות לטעויות ולהבדלים בשל מחלק מגיב לא טוב ואת הזיהום צולב. שיטות לניתוח phenoptypic של דם מלא anticoagulated הוקמו בסוף 1980 לשימוש מבחני מעבדה קליניים. אותן שיטות אלה לשרת את הצרכים של מעבדת מחקר עבור הכנת מדגם. חשוב לציין, קוקטיילי הנוגדן משמש במעבדה הקלינית הם בדרך כלל פחות מורכבים AVAilable-titered טרום טרום מעורב מהיצרן. רק העברה אחת של הקוקטייל של הנוגדנים מראש מעורב נדרשה. בתוך המסגרת למחקר, קוקטיילים נוגדן של 10-16 נוגדנים אופייניים. חייב להיות מאומת כל קוקטייל ליציבות על ידי מעבדה או מוכן טרי לפני כל assay. הכנת קוקטיילים מרובים נוגדן למדגם אולי כרוך pipetting של 50-80 נוגדנים אישיים, משימה שהיא גם מייגע לשגיאות.
אוטומציה של הכנת קוקטייל יש מספר יתרונות על פני הכנת קוקטייל ידנית כגון פחות שגיאות, גדל הדיוק של pipetting, ואולי אף ירידה בזבוז מגיב. כאן אנו מדווחים כניסתה המוצלחת של המטפל נוזלי אוטומטי מצויד בקורא ברקוד דו מימדי (2D) לתהליך תא מכתים של immunophenotyping למזער השתנות הקשורות לדגום הכנה.
Protocol
איסוף ושימוש בדם ההיקפי בפרוטוקול זה אושר על ידי בריאות פרובידנס ושירותי דירקטוריון הסקירה המוסדית. כל בבני אדם נתן את הסכמתו מדעת בכתב שלהם. הערה: בהתאם לצעדי יוניברסל. כל דם האדם ומחייב כאילו זיהומיות ויטופל בהתאם לכללי 2 רמת הבטיחות הביולוגית. הערה: immunophenotyping עם הדם היקפי כולו מבוצעת על ידי דוגרי anticoagulated דם שלם עם נוגדנים חד שבטיים ניאון מתויג לזהות אנטיגנים פני תא, ואחריו תמוגה hypotonic להסיר תאי דם אדומים. תאים נשטפים ואת המדגם מנותח על ידי cytometer זרימה. השיטה המתוארת במסמך זה מתמקד בהכנת קוקטיילים נוגדן באמצעות המטפל נוזלי אוטומטי מצויד בקורא ברקוד 2D. ראשית, "קוקטייל Base" שמזהה תת תא חיסון ואת "קוקטייל ההפעלה" מנטרת iאנטיגנים nducible ערוכים בנפרד (טבלה 1). ואז הוא הקוקטיילים מעורבבים ליצור "קוקטייל נוגדן מאסטר". ראה איור 1 עבור זרימת עבודה. 1. דגימה איסוף דם היקפיים באמצעות venipuncture בתוך שפופרת איסוף דם anticoagulated הפרין סודיום, להפוך מספר פעמים בעדינות כדי להבטיח ערבוב ראויה, ולאחר מכן החזק ב RT. דחה דגימה אם קרוש או hemolyzed 13. 2. הכנת Labware לייבל 2D צינורות ברקוד עם תוויות קריאות (שם נוגדן, למוכר, מספר הקטלוגי, ומספר הרבה). עבר תוכן של בקבוקוני נוגדן מן למוכר (המפורטים בטבלה 1) כדי מקביל צינורות ברקוד 2D. הערה: קח בזהירות רבה כדי לא להכניס בועות כמו בועות שקרית לעורר חישת רמת נוזל (LLS) שתוצאתו ההעברה הכי מוצלחת של מגיב. הערה: ודא שכל vi נוגדןיש אל נוגדן מספיק הריצה. קרא את ברקוד 2D עבור כל צינור ידי קורא ברקוד 2D. הכן גיליון אלקטרוני המכיל את שמות נוגדן (AB) ו ברקוד קורא (BC) באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני ולשמור אותו בתוך ערכים מופרדים בפסיקים (CSV) הקובץ בשם "AB_BC.csv" (טבלה 2). הערה: הקפד לעצב תאים כמו "טקסט" לא "מספר" על מנת לשמור על "0" הראשון עבור מספרים ברקוד אם בכלל (למשל, 0163562544). הוסף "x, 0000000000" בסוף לציין סוף נתונים. לוחות מתכת בורג LLS למסגרת של הסיפון חובט נוזלי אוטומטית כדי לאפשר LLS. 3. תכנה עבור הנדלר האוטומטי הנוזל הערה: שני שיטות תתוכנתנה בתוכנה עבור מטפל הנוזלי האוטומטית: א) שיטה להכנה "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלה" ב 3.1), ו ב) שיטה להכנה "מאסטר Antiboקוקטייל dy "על ידי שילוב של" קוקטייל Base "ו" קוקטייל הפעלה "ב 3.2) (איור 1). צור שיטה להכנה "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלה" (איור 2). באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני, ליצור גיליון אלקטרוני הכולל מידע לשמות נוגדן (AB_NAME), מיקום צינור היעד (טוב-BASE או WELL-ACT), ונפח (VOL) ב μl עבור "קוקטייל Base" עם טיפים P50 (BASE_CT_P50: טבלה 3) או טיפים P200 (BASE_CT_P200: טבלה 4) ו "קוקטייל הפעלת" עם טיפים P50 (ACT_CT_P50: טבלה 5) או טיפים P200 (ACT_CT_P200: לוח 6). ולשמור אותם כקבצי CSV. לקבלה "WELL-BASE" ו "WELL-ACT" מיקום, מתייחס למספרים באיור 3. הערה: VOL = x כייל (# של מכתים + 2) μl. כותרות בטבלת 1 הן הרבה ספציפיות. מפעיל צריך לקבוע ציציאה לכל נוגדן כפי שתואר על ידי אחרים 14. לחץ על סמל כדי להפעיל את התוכנה עבור מטפל הנוזלי האוטומטית במחשב כדי ליצור שיטה להכנה "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלה". הערה: השלבים הבאים 3.1.3-3.1.7 יגדיר את מעבדתי: מתלה צינור עם צינורות ברקוד 2D (איור 4). מדידות ניתנות כהפניה. החוקרים צריכים לקבוע ולהתאים עבור כל מכשיר. בסרגל הכלים תחת "פרויקט", בחר "עורך סוג Labware". לחץ לחיצה ימנית על אובייקט עבור צלחת 96 באר שטוחה, בחר "העתק" והקלד "Matrix_OneML_TubeRack" בחלון מוקפץ. לחץ פעמיים על האובייקט "Matrix_OneML_TubeRack" כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח. הדגש "מידע בסיסי", להגדיר 12.775 ס"מ (X) ו 8.546 ס"מ (Y) עבור "Span" ו 4.625 ס"מ עבור "גובה". (איור 4 א). לאחר מכן, גולת הכותרת "Movemמידע אף אוזן גרון ". הגדר גריפר לקזז 0 (X), 0 (Y), ו -0.3 (Z), גריפר לסחוט -0.1cm, גריפר Unsqueeze 2.6 ס"מ, מגבלת מהירות 75%, ולאחר מכן לבדוק" השתמש חיישן תפסן "(איור 4B). ואז, לסמן "Well_1". הגדר כדלקמן: "ובכן אופסט"; 1.5 ס"מ (X) ו 1.13 ס"מ (Y), "ובכן הרוזן"; 12 (X) ו -8 (Y), "ובכן ריווח"; 0.9 (X) ו -0.9 (Y), "נפח מקסימאלי"; 1,500 μl, פורמט "; רגיל," קולום 2 אופסט "; 0, ו" נפח מחדל "; 0 (איור 4C). לבסוף, לחץ על "ערוך …" כפתור בצד ימין של "ובכן תצורה" (איור 4C). בחלון מוקפץ, מוגדר כדלקמן: "Shape"; עגול, "רדיוס עליון"; 0.37 ס"מ, "תחתון רדיוס"; 0.37 ס"מ, ו "גובה"; 3.9 ס"מ. בדוק "בחלק התחתון" ולהגדיר "שייפ"; קונוס, "רדיוס"; 0.37 ס"מ, ו "גובה"; 0.4 ס"מ (איור 4D). הערה: השלבים הבאים 3.1.8-3.1.11 יגדיר את מעבדתי: מתלה צינור עם צינורות microfuge. מדידות ניתנות כהפניה. החוקרים צריכים לקבוע ולהתאים עבור כל מכשיר. בסרגל הכלים תחת "פרויקט", בחר "עורך סוג Labware". לחץ לחיצה ימנית על האובייקט עבור מתלת 24 מיקום, בחר "העתק" וסוג "SmallTuberack_microfugetubes". לחץ פעמיים על האובייקט "SmallTuberack_microfugetubes" כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח. הדגש "מידע בסיסי", להגדיר 12.75 ס"מ (X) ו -8.5 ס"מ (Y) עבור "Span" ו 3.95 ס"מ עבור "גובה". הבא, לסמן "Well_1". הגדר כדלקמן: "ובכן אופסט"; 1.621 ס"מ (X) ו 1.181 ס"מ (Y), "ובכן הרוזן"; 6 (X) ו -4 (Y), "ובכן ריווח"; 1.9 (X) ו -1.9 (Y), "נפח מקסימאלי"; 1,000 μl, פורמט "; רגיל," קולום 2 אופסט "; 0, ו" נפח מחדל "; 0. לבסוף, לחץעל "ערוך …" כפתור בצד ימין של "תצורה ובכן". בחלון מוקפץ, מוגדר כדלקמן: "Shape"; עגול, "רדיוס עליון"; 0.3345 ס"מ, "תחתון רדיוס"; 0.274 ס"מ, ו "גובה"; 3.6728 ס"מ. בדוק "בחלק התחתון" ולהגדיר "שייפ"; בחצי הכדור, ו "רדיוס"; 0.1575 ס"מ. הערה: השלבים הבאים 3.1.12-3.1.35 יסביר כיצד לתכנת את "השיטה החדשה" לביצוע "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלה" (איור 2). לחץ על סמל "השיטה החדשה" ופתוח. גרור "IF" סמל בין סמל "התחל" ו "סיום" בשיטה החדשה (איור 2). לחץ וסמן את הסמל "IF". הקלד את הטקסט הבא עבור מצב:. CreateObject ( "World.EngineObject") המדמה הערה: פעולה זו תמנע את התוכנה מלבצע בדיקת שגיאות ולאפשר בשיטה זו כדי לעבוד. ללא צעד זה, שלoftware יתריע מידע חסר עבור בסיס נתונים כמו ברקוד קורא זמינים רק לאחר הצעד "VisionMate: לקרוא ברקודים" המתואר 3.1.20). מאז שלב זה משבית את שלב אימות בתוכנה, המפעיל חייב לאשר יש מספיק טיפים מגיבים על הסיפון כדי לבצע שיטה זו. הכנס סמל "הגדרת Instrument" בין הסמל "ואז" ואת הסמל "סוף" הראשון תחת הסמל "IF" (איור 2). הערה: כל השלבים הבאים, תוכל לגרור סמלים בין סמל "אחר" ואת סמל "End" השני תחת הסמל "IF" כך שצעדים כמוסות של "אחר". גרור את הסמל "הגדרת Instrument" מתחת לסמל "האחר" בשיטה (איור 2). לחץ על סמל "הגדרת Instrument" בשיטה כדי לפתוח את החלון. הגדר labwares ידי גרירת אייקונים טיפים מסוננים P50 LLS, טיפים מסוננים P200 LLS, P1000 טיפים, "Matrix_OneML_TubeRack", שני "SmallTuberack_microfugetubes", ואת המאגר למיקום סיפון מקביל מרשימת הסמל. פתח את תיבת הדו-שיח של "Matrix_OneML_TubeRack" ואת שם כמו "AB_BOX". פתח את תיבת הדו-שיח של "SmallTuberack_microfugetubes" ולהעניק לו שם אחד כמו "BASE_CT" לקוקטיילים מאגר והשני כמו "ACT_CT" לקוקטיילים ההפעלה (איור 5). גרור סמל "העברה" לשיטה (איור 2) להוסיף צעד להעברת חיץ מהמאגר לתוך צינורות microfuge עבור "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלה". נפח העברה = 25 x μl (# מכתים +2) עבור "קוקטייל Base" ו = 25 x μl (# מכתים +2) עבור "קוקטייל הפעלה". להוסיף שלבים על הזזת "Matrix_OneML_TubeRack" על קורא ברקוד 2D. גרור סמל "VisionMate עבר" לשיטה (אלחוטיאיור 2) וציין את מהלך מעמדת סיפון המקור לעמדת הקורא ברקוד על הסיפון. גרור "VisionMate: לקרוא ברקודים" סמל לשיטה (איור 2). פתח את תיבת הדו-שיח, ובחרו "VisionMate" כהתקן ולהעניק לו שם ערכת הנתונים כמו "BC_Read". גרור "משתמש השהה" (איור 2), בחר "השהה את המערכת כולה ולהציג הודעה זו" והקלידו תגובה לתחום להזכיר למשתמשים של המאשר כי כל ברקודים נקראים לפני שתמשיך לשלב הבא. הערה: השלבים הבאים 3.1.22-3.1.26 תקשר בין מיקום בארות ושמות נוגדן שימוש במידע ברקוד. זה יאפשר המטפל הנוזלי האוטומטי למצוא מיקום של נוגדן המסוים בהתבסס על שם הנוגדן "א.ב.". גרור סמל "דיווח שלב" לשיטה (איור 2). ערוך קובץ טקסט באמצעות תכנית טקסט ולשמור אותוכמו "BC_Readout" בתיקיית המסמכים במחשב. פתח את תיבת הדו-שיח עבור "דיווח שלב", לבחור "קובץ טקסט" עבור סגנון דווח, ובחרו בקובץ "BC_Readout" דרך הגלישה. הערה: קובץ "BC_Readout" וכתוצאה מכך יכיל מידע עבור כל labwares על הסיפון למעט טיפים שמוגדרים 3.1.16 כולל מידע עבור ברקוד קורא לצינורות ברקוד 2D ומיקומים היטב "Matrix_OneML_TubeRack". הוספת "צור מערך נתונים" צעד לקשר ברקוד ומידע היטב. גרור את הסמל "צור מערך נתונים" לשיטה (איור 2), לחץ עליו כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח, בחר "קרא מקובץ" ובחר "AB_BC.csv" (טבלה 2 שנוצר 2.4), לבדוק "פסיק- מופרד "ו" קובץ יש שורת כותרת ". הערה: בחלון התצוגה המקדימה של הקובץ, שמות נוגדן (AB) ו ברקוד קוראים (BC) יש לראות. בשנות התיבת הדו-שיח ame עבור "יצירת מערך נתונים" ב 3.1.25, בחר "VM1" עבור מיקום מעבדתי ו "0" עבור עומק מחסנית, בחר "התאם את מזהה לדוגמא", ולהשתמש בשדה "לפני הספירה" כדי להתאים עם נתונים הגדר "BC_Read". בחר "א.ב." ו- "לפני הספירה" עבור "מערכי נתונים להיווצר" (איור 6). גרור סמל "VisionMate עבר" לשיטה (איור 2) וציין את מהלך המעמדת קורא ברקוד "VM1" בחזרה למיקום הסיפון הראשוני על הסיפון. הערה: השלבים הבאים 3.1.28-3.1.33 יגדיר העברת צעד עבור "קוקטייל Base". גרור סמל "Worklist" (איור 2) ולעיין כדי לבחור את הקובץ worklist "Base_CT_P50" (לוח 3) שנוצר 3.1.1. בדוק "worklist כולו Loop". גרור את סמל "העברה" ישירות מתחת לסמל "Worklist" (איור 2). </ Li> לחץ על סמל "העברה" כדי לפתוח את השדה המפרט. בחר פריט אחד בלבד של הבדיקות, P50 LLS מסונן טיפים, בחר "לפרוק אותם" כאשר ההעברה נעשית, ולבדוק "טיפי שינוי בין העברות". הוסף מקור על ידי לחיצה על "לחץ כאן כדי להוסיף מקור", בחר "Matrix_OneML_TubeRack" בתור מעבדתי, ומיקום בחר על הסיפון לפי שם "AB_BOX". בתחום המפרט עבור "העברה", "זום" על התרשים של 96 בארות על ידי לחיצה ימנית ולבחור "א.ב." מייד לאחר "למערך נתוני שימוש" ולבחור לאן וערכיה "שווים" ו "= AB_NAME" . טכניקת העברה בוחר בחירה. הערה: שימוש LLS מומלץ מאוד להימנע מקבלת פסולת זרזה ליד תחתון. בתחום המפרט עבור "העברה", בחר יעד על ידי לחיצה על "לחץ כאן כדי להוסיף יעד", לחץ לחיצה ימנית כדי להגדיל ובחר "SmallTuberack_microfugetubes "בתור מעבדתי, נפח כ" = VOL ", ומיקום על הסיפון לפי שם" BASE_CT ". לאחר התרחקות, לחץ לחיצה ימנית שוב, לבדוק" ציין בחירה כטקסט ", ולבדוק" ציין את מטרות עם הביטוי להלן: "והסוג" = WELL_BASE "כמשתנה לתפקיד סיפון יעד. חזור 3.1.29-3.1.32 דומה עבור "קוקטייל Base" עם טיפי P200, על ידי בחירת קובץ CSV "Base_CT_P200" (לוח 4) ולאחר מכן בחר P200 LLS מסונן טיפים כמו גם טכניקת פיפטה מתאימה טיפים מסוננים P200 LLS. הערה: השלבים הבאים 3.1.34 ו 3.1.35 יגדיר העברת צעד עבור "קוקטייל הפעלה". חזור 3.1.29-3.1.32 דומה עבור "קוקטייל הפעלה" עם טיפי P50, על ידי בחירת קובץ CSV "ACT_CT_P50" (לוח 5) והבחירה "ACT_CT" כיעד. לחץ לחיצה ימנית על יעד ולבדוק "ציין בחירה כטקסט";. בדוק "ציינתי את המטרות עם הביטוי להלן:" וסוג "= WELL_ACT" כמשתנה לתפקיד יעד. חזור 3.1.34 דומה עבור "קוקטייל הפעלת" עם טיפים P200, על ידי בחירת קובץ CSV "ACT_CT_P200" (לוח 6) וטיפים מסוננים P200 LLS. הערה: השיטה להכנה "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלה" יכולה להיות סגורה לאחר שמירה. צור שיטה חדשה להכנת "קוקטייל מאסטר נוגדן" על ידי שילוב של "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלת" לתוך 5 מ"ל צינורות פוליסטירן מסביב לתחתית (איור 7). הערה: השלבים הבאים 3.2.1-3.2.6 יגדיר את מעבדתי: מתלה צינור עם 5 מ"ל צינורות פוליסטירן מסביב לתחתית. מספרים מיועדים לצורך עיון. החוקרים צריכים לקבוע ולהתאים עבור המכשיר. בסרגל הכלים תחת "פרויקט", בחר "עורך סוג Labware". ימני CLאיכס על אובייקט עבור מתלת 24 מיקום, בחר "העתק" והקלד "BiocisionCoolRack_XT" בחלון מוקפץ. לחץ פעמיים על האובייקט "BiocisionCoolRack_XT" כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח. הדגש "מידע בסיסי", להגדיר 12.78 ס"מ (X) ו 8.57 ס"מ (Y) עבור "Span" ו 7.93 ס"מ עבור "גובה". דגש "Well_1". הגדר כדלקמן: "ובכן אופסט"; 1.55 ס"מ (X) ו 1.33 ס"מ (Y), "ובכן הרוזן"; 6 (X) ו -4 (Y), "ובכן ריווח"; 1.95 (X) ו 1.97 (Y), "נפח מקסימאלי"; 2,000 μl, פורמט "; רגיל," קולום 2 אופסט "; 0, ו" נפח מחדל "; 0. פתח "ובכן תצורה" לערוך. גדר כדלקמן: "עצב"; עגול, "רדיוס עליון"; 0.5375 ס"מ, "תחתון רדיוס"; 0.48 ס"מ, ו "גובה"; 7.07 ס"מ. בדוק "בחלק התחתון" ולהגדיר "שייפ"; בחצי הכדור, ו "רדיוס"; 0.45 ס"מ. הערה: השלבים הבאים3.2.6-3.2.7 יגדיר צעדי העברה ומשומש בשלב 3.2.14. יצירת קובץ CSV "AB_MACT" (לוח 7) להכנת קוקטייל של נוגדנים עם הכותרות הבאות: א) "SRC_BASE"; שם מעבדתי עבור "קוקטייל Base", ב) "WELL_BASE"; גם מקומות מעבדתי עבור "קוקטייל Base", ג) "VOL_BASE"; נפח העברה עבור "קוקטייל Base" ב μl, ד) "SRC_ACT"; שם מעבדתי עבור "קוקטייל הפעלה", ה) "WELL_ACT"; גם מקומות מעבדתי עבור "קוקטייל הפעלה", ו) "VOL_ACT"; נפח העברה עבור "קוקטייל הפעלה" ב μl, ז) "DEST_MACT"; מידע מיקום סיפון עבור "קוקטייל נוגדן מאסטר", ו- h) "WELL_MACT"; גם למקם מידע מתל הצינור עבור "קוקטייל נוגדן מאסטר". מלא את פרטים תחת כותרות שנוצרו 3.2.6) (לוח 7) כדלקמן: א) להשתמש "BASE_CT"תחת SRC_BASE, ב) מידע המיקום ברשימה גם עבור "WELL_BASE" כפי שמוצג באיור 3 א, ג) בהיקף כולל רשימה של נוגדנים (25 μl של חיץ + סכום כל טיטר נוגדנים בסיס מכתים יחיד) תחת "VOL_BASE", ד) להשתמש "ACT_CT" תחת SRC_ACT, ה) רשימה גם מידע המיקום עבור "WELL_BASE" כפי שמוצג באיור 3 ב, ו) בהיקף כולל רשימה של נוגדנים (25 μl של חיץ + סכום כל טיטר נוגדנים הפעלה עבור מכתים יחיד) תחת "VOL_ACT". העברת 25 μl של חיץ עבור T-Cell FM3. עיין בטבלה 1 עבור בדיקות 1-3, ז) להשתמש "SPL_TUBES_1" (ראה 3.2.10) עבור "DEST_MACT", ו- h) מידע המיקום ברשימה גם עבור "WELL_MACT" כפי שמוצג באיור 8. הערה: השלבים הבאים 3.2.8-3.2.15 יתכנת את השיטה להכנת "קוקטייל נוגדן מאסטר" פתח שיטה חדשה (איור 7). גרור את "Instrסמל התקנה "ument השיטה חדש (איור 7). בתחום המפרט של "הגדרת כלי", לגרור סמלים עבור טיפים P1000, שני "SmallTuberack_microfugetubes", ו "BiocisionCoolRack_XT" על התרשים הסיפון. פתח את תיבת הדו-שיח עבור שני "SmallTuberack_microfugetubes" ואת שם כמו "BASE_CT" ו "ACT_CT", בהתאמה, כמפורט 3.1.17. פתח את תיבת הדו-שיח עבור "BiocisionCoolRack_XT" ואת שם כמו "SPL_TUBES_1" כמפורט 3.2.7 (איור 9). הוספה "קבוצה" חדשה על-ידי גרירת סמל "קבוצה" לשיטה (איור 7). גרור את הסמל "ההעברה מקובצת" ישירות מתחת לסמל "הקבוצה" להעביר "קוקטייל Base" להכנה "קוקטייל נוגדן מאסטר" (איור 7). בתחום המפרט עבור "העברת מקובץ", בחר טיפי P1000 בשימוש, sנבחר "לפרוק אותם" כאשר ההעברה נעשית, ולבדוק "טיפי שינוי בין העברות". בתחום המפרט עבור "העברת מקובץ", בחר את הקובץ "AB_MACT" (לוח 7) על ידי גלישה, לבדוק "יש קובץ שורת כותרת". בחר "SRC_BASE" לתפקיד מעבדתי המקור "WELL_BASE" למידע היטב מעבדתי מקור, בחר "DEST_MACT" עבור מעבדתי יעד "WELL_MACT" למידע היטב מעבדתי היעד, ובחר "VOL_BASE" למידע נפח (איור 10). בחר טכניקת העברה מתאימה טיפי P1000. הערה: LLS ייתכן שלא יהיה צורך עבור תהליך זה. הוסף עוד "העברת מקובץ" על ידי גרירתו ישירות מתחת "קבוצה" כדי להעביר את "קוקטייל ההפעלה", כלומר להיות מעורב עם "קוקטייל Base" להכנה "קוקטייל נוגדן מאסטר" (7 איור </ Strong>). באופן דומה להגדיר את צעד ההעברה כמו 3.2.13 ו 3.2.14. יוצאי הדופן הם כדלקמן: א) בחר "SRC_ACT" לתפקיד מעבדתי מקור, ב) "WELL_ACT" למידע היטב מעבדתי המקור, ג) "VOL_ACT" למידע נפח. 4. נוהל הפעלה ראשית, לחץ פעמיים על סמל התוכנה כדי להפעיל את קורא ברקוד 2D במחשב. לאחר מכן, לחץ לחיצה כפולה על סמל התוכנה כדי להפעיל את המטפל נוזלי אוטומטי במחשב. תחת "כלי", בחר "צירי כל בית" כדי מזרקי ממשלה של מטפל הנוזלי האוטומטי. ודא שכל המזרקים אינם מכילים בועות אוויר גלויות. הערה: "בית כל הצירים" גם ייתן המכשיר נקודת התייחסות שממנו ניתן לבצע מהלכים לאחר מכן. פתח את השיטה להכנה "קוקטייל Base" ואת "קוקטייל ההפעלה" (איור 2) בתוכנה עבור אמטפל נוזל utomated. מניחים את הצינורות microfuge לתוך "SmallTuberack_microfugetubes" עבור "BASE_CT" ו "ACT_CT" לפי מספר "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלת" להתבצע (איור 3). ואז למקם אותם על הסיפון פי "הגדרת כלי" (איור 5). מניחים את המאגר עם חיץ על הסיפון פי "הגדרת Instrument". דה-כובע 2D צינורות ברקוד המכיל נוגדנים באמצעות decapper מתברג 8 ערוצים. שמור כובעים כדי מדויקים על מגש מחזיק כובע כדי למנוע זיהום צולב. מניחים את "Matrix_OneML_TubeRack" על הסיפון פי "הגדרת כלי" (איור 5). LLS טיפים P50 מקום מסוננים, טיפים מסוננים P200 LLS, וטיפים P1000 על הסיפון פי "הגדרת כלי" (איור 5). הפעל את השיטה על ידי לחיצה על תלת הירוקהזווית בצורת סמל ההתחלה. כפי שיתבקש על ידי החלון הקופץ, לוודא שכל פריטים על הסיפון להתאים את "הגדרת Instrument" כהגדרתו השיטה. אל תניחו חפצים שאינם רשומים ב "הגדרת Instrument" על הסיפון, מאחר שהדבר עשוי לרסק את תרמיל ו / או תפסן. לחצו על "אישור" כדי להמשיך. לאחר "Matrix_OneML_TubeRack" הוא עבר לעבוד על הקורא ברקוד 2D ברקודים נקראים, חלון קופץ אחר ישאל אם כל ברקודים נקראות. המשך על ידי לחיצה על "אישור" אשר פעם. עם השלמת ההעברה ידי מטפל הנוזלי האוטומטי, לסכם את הצינורות המינימרקטים 2D באמצעות decapper מתברג 8 ערוצים, ולשים אותם בחזרה 4 מעלות צלזיוס. וורטקס כל הצינורות microfuge במרץ למשך 20 שניות, ולהחזיר אותם אל מדפי הצינור. הערה: vortexing לא מספיק עלול לגרום מכתים הכי מוצלח של תאים. סגור את השיטה להכנה "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלה". לאחר מכן פתח את השיטה להכנה "קוקטייל נוגדן מאסטר". הגדרת צינורות קלקר מראש שכותרתו 5 מ"ל מסביב לתחתית על "BiocisionCoolRack_XT" (איור 8) ומניחים אותו על הסיפון. תוויות צריכות לציין מה "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלה" מעורבבים, כמו גם זיהוי המטופל המתאים. מניחים מתלים צינור עבור "קוקטייל Base", "קוקטייל הפעלת", וטיפים P1000 על הסיפון (איור 9). הפעל את השיטה (איור 7). כפי שיתבקש על ידי החלון הקופץ, לוודא כי פריטים על התקנת Instrumental משחק סיפון בשיטה (איור 9). לחצו על "אישור" כדי להמשיך. כאשר התהליך הנ"ל נעשה, להוסיף ידנית 50 μl של דגימות דם לתוך כל 5 מ"ל צינור קלקר מסביב לתחתית המכיל את קוקטייל של נוגדנים. דוגמיות וורטקס בתוך ארון בטיחות ביולוגית Class II ו דגירה 15 דקות ב RT בחושך. טאקטיפול דואר להימנע מריחות דם בצידי הצינורות, כמו זו תגרום מכתים עקבי. מוציאים בזהירות כל שכתמי הדם על ידי צמר גפן טבולה חיץ לשטוף זרימה. הוסף 1 מ"ל של חיץ תמוגה RBC ידני דגירה 15 דקות ב RT בחושך. הוסף 2 מ"ל של חיץ זרימה לשטוף (אזיד הנתרן 0.1%, 1% BSA, 10 הפרין U / ml ב 1x HBSS) ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 400 x. בטל supernatant בתוך ארון בטיחות ביולוגית Class II. חזור על תהליך זה כביסה. מחדש להשעות התאים מוכתם ב 0.5 מ"ל של חיץ לשטוף זרימה. הגדרת cytometer זרימה כי הוא מצויד לייזרים קמח מסננים מתאימים, ודגימות להפעיל באמצעות 5 מ"ל מסביב לתחתית צינורות קלקר. השתמשו בשיטות כיול ופיצוי הקרינה cytometer תקן לאיסוף נתונים 12,15. לאסוף את כל הפרמטרים המפורטים "Fluorophore" בטבלה 1. הערה: חומרי בקרה נאותים אמור לשמש כל סיבוב כדי להבטיח את התחת הולםביצועים איי. לאחר דגימות ריצה, יצוא רכש נתונים כקבצי FCS. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה מתאימה. לזהות תת תא T משתמש באסטרטגיה gating שהתוותה פרויקט אימונולוגיה האדם 1.
Representative Results
מטרת immunophenotyping הדם כולו היא להשיג כמותית (הסימון של תת תא חיסון) ואיכותי (זיהוי מצב הפעלה) מידע על תאי מערכת חיסון. יש לנו שונה מעט בלוח התא immunophenotyping T המוצע על ידי פרויקט אימונולוגיה האנושי 1 לשפר את התפקוד הכללי של שיטה שלנו (טבלה 1). לוח תא T שלנו שואפים לזהות נאיבי, זיכרון מרכזי (CM), זיכרון מפעיל (EM), ותאי T מפעיל. בקצרה, אנחנו להפלות כפילויות מבוססות על FCS-A ו- FCS-H. אז אנחנו השער על הלימפוציטים מבוסס על פיזור צד ורמות CD45. תאי T מזוהים מכן על ידי ביטוי CD3. תאי CD3 + T הם מובחנים לתאים γδ T ותאי T αβ. תאי αβ T מחולקים נוספים לתוך CD4 + ו- CD8 + T תאים. תאי CD4 + ו- CD8 + T מנותחים אז עבור תת שלהם מבוסס על expression של CD45RA ו CCR7: CD45RA – CCR7 + CM, CD45RA + CCR7 + נאיבית, CCR7 CD45RA + – מפעיל, ו CD45RA – CCR7 – תאים EM T 1. בנוסף, אנו גם לפקח הביטוי שלהם של סמנים הפעלה כגון CD38, HLA-DR, ICOS, PD-1, GITR, 4-1BB, CD69, NKG2D, ו OX40 להשיג מידע איכותי. כדי להדגים את הדיוק של השיטה זו, אנו מוכתמים דגימות דם כולו היקפיות מ -4 תורמים בריאים 5 פעמים ביום אחד. איור 11 מראה את קשר בין תת-אוכלוסיית תא אחוזי T על לימפוציטים מגודר מקדם האחוז השונה (CV%). פירוט מפורט של תת-אוכלוסיות של תאי T אחוז על לימפוציטים מגודר ו CV% עבור כל קבוצת משנה מוצג בטבלה 8. נתונים מבדיקות 2 ו -3 אינם נכלל איור 11 ולוח 8 לפשטות. פחות מ -25% CVבין ריצה (דיוק הבין-assay) הוצע הקריטריונים לקבלה עבור מבחני סמן ביולוגי פנוטיפי לשימוש המחקר 10. כל המדידות תאמו את קריטריון זה למעט ICOS + γδ ותאי T (26.64-46.39%. לוח 8) ו ICOS תאים + CD8 T (14.64-58.39%. לוח 8). ערכים אלה מוצגים למטרות הדגמה. אנחנו לא לנצל מדידות אלה משום ICOS בעיקר ממלא תפקיד חשוב בהפעלת תאי CD4 T 16. מגמת CV% יותר באוכלוסיות אשר מהווים אחוז נמוך עבור כלל האוכלוסייה נצפתה על ידי אחרים 7. בשנת החוקרים במקרה מעוניינים ניטור אירועים נדירים, מספר תאים שנבדקו צריך להיות מוגברת על מנת להתגבר על חוסר הדיוק יותר 17. יחד, נתונים שלנו להראות את היישום המוצלח של אוטומציה בהכנת המדגם של immunophenotyping הדם כולו. < img alt = "איור 1" src = "/ files / ftp_upload / 53,485 / 53485fig1.jpg" /> באיור 1. Workflow עבור immunophenotyping עם כל הדם ההיקפיים. צעד אחר צעד עבודה של assay immunophenotypic מוצג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. סקירה כללית של השיטה להכנה "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלה". שלבים בשיטה להכנה "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלה" בתוכנה עבור מטפל הנוזלי האוטומטיים מוצגים. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו. דואר 3 "src =" / files / ftp_upload / 53,485 / 53485fig3.jpg "/> פריסה איור 3. עבור מתלה צינור עם BACE_CT ו ACT_CT. (א) מראה פריסה עבור מתלה צינור "BACE_CT". (ב) מראה פריסה עבור מתלת הצינור "ACT_CT". אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4. ההגדרה Labware עבור מתלה צינור עם צינורות ברקוד 2D. צעד אחר צעד תהליך של הגדרת מתלה צינור עם צינורות ברקוד 2D. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 485fig5.jpg "/> איור 5. התקנת Instrument עבור השיטה להכנה "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלה". הוא מציג את פריסת הסיפון עבור השיטה להכנה "קוקטייל Base" ו "קוקטייל הפעלה". אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דְמוּת. התקנת איור 6. עבור "יצירת מערך נתונים". זה מראה הגדרה מפורטת "צור מערך נתונים". אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. figu מחדש 7. סקירה של השיטה להכנה "קוקטייל נוגדן מאסטר". שלבים בשיטה להכנה "קוקטייל מאסטר נוגדן" בתוכנה עבור מטפל הנוזלי האוטומטיים מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 8. פריסה עבור מתלה צינור עם 5 מ"ל צינורות פוליסטירן מסביב לתחתית. זה מראה פריסה עבור מתלה צינור "SPL_TUBES_1". FM3 אומר הקרינה מינוס 3 (סגול מבריק 421, Phycoerythrin, ו allophycocyanin). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. ftp_upload / 53,485 / 53485fig9.jpg "/> איור 9. התקנת Instrument עבור השיטה להכנה "קוקטייל נוגדן מאסטר". הוא מציג את פריסת הסיפון עבור השיטה להכנה "קוקטייל מאסטר נוגדן". אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 10. התקנה עבור "העברת מקובץ". זה מראה הגדרה מפורטת "העברת מקובץ". אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. Vari איור 11. נמוך היכולת ב immunophenotyping דם חצי האוטומטי כולה. ערכי CV יחידים של כל אוכלוסיות התאים נתחו מארבעה תורמים בריאים מוצגות מעגל פתוח כחול. עקומת רגרסיה מוצגת הקו הכחול. אדום מנוקד קווים מצביעים 95% להקות בטוחות קווים מקווקווי חמדנות להראות 95% להקות חיזוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 12. דוגמה מכתים לא טובים. מכתים נערך עם vortexing נאותה או לקוי של צינורות microfuge מ "BACE_CT" ו "ACT_CT". יש שתי אוכלוסיות מגודרות בסי. אוכלוסיית הקטין עם מכתים CD45 חלש מייצגת תאים שאינם מקבלים מכתים אופטימלי.g12large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. קְבוּצָה סַמָן fluorophore Clone כייל (μl / מכתים) קוקטייל BASE TCELL CD45 FITC 2D1 0.4 CD3 Alexa700 UCHT1 1 CD8 APC-H7 sK1 0.4 CD4 PerCP-CY5.5 SK3 2 CCR7 PE-CF594 150,503 1 CD45RA PE-Cy7 L48 1 TCRab BV786 </Td> T10B9.1A-31 1 TCRgd BV650 B1 5 קוקטייל-1 הפעלה TEST1 HLA-DR BV421 G46-6 5 CD278 (ICOS) פ DX29 5 CD38 APC HB7 1 קוקטייל-2 ההפעלה TEST2 CD279 (PD1) BV421 EH12.1 2.5 CD357 (GITR) פ eBioAITR 5 CD137 (41BB) APC 4B4-1 10 קוקטייל-3 הפעלה TEST3 CD69 BV421 FN50 1 </Td> CD314 (NKG2D) פ 1D11 2 CD134 (OX40) APC ACT35 5 טבלת 1. רשימת נוגדן עבור פנל תא T השונה. א.ב. לִפנֵי הַסְפִירָה CD45_FITC 0163562388 CD3_Alexa700 0163562110 CD4_PerCP_CY5.5 0163562364 CD8_APC-H7 0163562363 CCR7_PE-CF594 0163562387 CD45RA_PE-Cy7 0163562091 TCRab_BV786 0163562069 TCRgd_BV650 0163562108 <tד> A_HLA-DR_BV421 0163562339 A_CD278 (ICOS) _PE 0163562082 A_CD38_APC 0163562317 A_CD279 (PD1) _BV421 0163562340 A_CD357 (GITR) _PE 0163562093 A_CD137 (41BB) _APC 0163562315 A_CD69_BV421 0163562341 A_CD314 (NKG2D) _PE 0163562314 A_CD134 (OX40) _APC 0163562316 טבלה 2. שמות נוגדן עם מספרים ברקוד 2D. קְבוּצָה WELL_BASE AB_NAME VOL TCELL 1 <tד> CD8_APC-H7 7.2 TCELL 1 CD45_FITC 7.2 TCELL 1 CD3_Alexa700 18 TCELL 1 CCR7_PE-CF594 18 TCELL 1 CD45RA_PE-Cy7 18 TCELL 1 TCRab_BV786 18 לוח 3. קובץ "BASE_CT_P50": שמות נוגדן ומידע נפח. קְבוּצָה WELL_BASE AB_NAME VOL TCELL </td> 1 CD4_PerCP_CY5.5 36 TCELL 1 TCRgd_BV650 90 לוח 4. קובץ "BASE_CT_P200": שמות נוגדן ומידע נפח. קְבוּצָה WELL_ACT AB_NAME VOL TEST1 7 A_HLA-DR_BV421 30 TEST1 7 A_CD278 (ICOS) _PE 30 TEST1 7 A_CD38_APC 6 TEST2 13 A_CD279 (PD1) _BV421 15 TEST2 13 A_CD357 (GITR) _PE 30 TEST3 19 A_CD314 (NKG2D) _PE 12 TEST3 19 A_CD69_BV421 6 TEST3 19 A_CD134 (OX40) _APC 30 לוח 5: קובץ "ACT_ CT_P50": שמות נוגדן ומידע נפח. קְבוּצָה WELL_ACT AB_NAME VOL TEST2 13 A_CD137 (41BB) _APC 60 לוח 6: קובץ "ACT_CT _P200": שמות נוגדן ומידע נפח. תוֹרֵם# SRC_ בָּסִיס קוקטייל BASE טוֹב_ בָּסִיס VOL_ בָּסִיס SRC_ACT ACTI- VATION קוקטייל טוֹב_ חוֹק VOL_ACT DEST_MACT טוֹב_ MACT HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 </tד> 1 HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 7 HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 13 HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 19 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 2 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 <tד> ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 8 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 14 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 20 HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 3 HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 9 <tr> HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 15 HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 21 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 4 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 10 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 </tד> 13 42.5 SPL_TUBES_1 16 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 22 לוח 7: קובץ "AB_MACT": מקור ומידע היעד עבור "קוקטייל מאסטר נוגדן". # אוכלוסין באיור. 1 אני ii iii iv v שם אוכלוסין CD3 + תאי T ab תאי T gd CD3 + CD4 + CD3 + CD8 + % של לימפוציטים </Td> תורם Heathly # 1 79.80 75.20 2.70 49.60 22.30 תורם Heathly # 2 69.40 61.90 5.85 44.40 16.20 תורם Heathly # 3 75.80 69.60 4.75 42.00 23.50 תורם Heathly # 4 77.20 73.50 1.98 52.70 18.90 %קו"ח תורם Heathly # 1 1.42 1.58 3.70 2.50 1.56 תורם Heathly # 2 2.48 2.39 5.74 2.82 2.41 תורם Heathly # 3 1.15 1.40 6.32 1.42 2.72 תורם Heathly # 4 0.81 0.94 5.45 1.20 1.44 מְמוּצָע 1.47 1.58 5.30 1.99 2.03 סטיית תקן 0.72 0.61 1.13 0.79 0.63 לוח 8: נתונים גולמיים עבור% של לימפוציטים ו CV% עבור כל תת זממו באיור 4. שים לב שנתונים עבור בדיקות 2 ו -3 אינם מוצגים בתרשים 5 ולוח 8 לפשט מצגת נתונים.
Discussion
Immunophenotyping של דם היקפיים הוא בעל חשיבות מכרעת להשגת תובנות תגובות בודדות כדי אימונותרפיה. האתגר טמון סטנדרטיזציה assay לשלוט 1,14 השתנות הניסוי אל הניסוי. המקור עיקרי אחד השתנות טמונה המניפולציה האנושית של דגימות. לכן, לא מן הנמנע כי אוטומציה חלקית או מלאה של עיבוד מדגם תקל לירידה דרמטית 1,14 השתנות ניסוי אל ניסוי. בפרוטוקול זה, אנו מדווחים המאמץ המוצלח שלנו כדי למזער השתנות assay ידי החדרת מטפל נוזלי אוטומטי מצויד בקורא ברקוד 2D עבור מכתים מדגם immunophenotyping הדם כולו.
בתכנון, השיטה שלנו היא המגוונת יכולה לפקח תת אחר של מערכת חיסון על ידי הוספה נוסף "קוקטיילי מאגר" להגדירם. תת אלו כוללות תאי T מסייע, תאי רגולטוריים T, תאי B, תאי NK, תאים דנדריטים, ומונוציטים (כתב ידהכנה) 18. התאמנו את לוחות הנוגדן המומלץ של קונסורציום ידי החדרת סמנים נוספים 1. אוכלוסיות תאים זוהו באמצעות "קוקטייל Base" מצומדות כדי fluorochromes עם פליטה מינימלית לתוך 421 סגול מבריק (BV421), Phycoerythrin (PE), ו allophycocyanin (APC) גלאי, כמו שרצינו להזמין ערוצים אלה לצורך זיהוי של אנטיגנים מושרה. תכונה זו לא רק מבטיחה את הרגישות הגבוהה ביותר כדי לפקח על מצב הפעלה של תאי מערכת חיסון, אלא גם מאפשרת אירוח גמיש של סמני הפעלה חדשים כמו fluorochromes השלושה אלה מצומדות בתדירות הגבוהה ביותר עם נוגדנים כנגד סמנים מושרים. לכן, השיטה שלנו היא לא רק מתאים להכנת קוקטייל immunophenotyping הדם המלא אבל הוא גם שימושי עבור מכתים דוגמאות אחרות כוללים תאים ותאי דם היקפיים mononuclear התאוששו מרקמות מפוצלות (למשל, גידול).
intro מוצלחהיצור לפי השיטה שלנו דורש תשומת לב מיוחדת צעדים כהכנה מעבדתי, ואת תיכנות וביצוע של שיטה. הכנת הצינורות ברקוד 2D כוללת תיוג עם תוויות קריאות והעברה של נוגדני הצינורות המיועדים. כדי למנוע את כניסתה של שגיאות, אנו ממליצים לעשות זאת עם שני אנשים. בכל פעם שינוי גיליונות אלקטרוניים, החוקרים צריכים לבדוק אם השיטה עובדת כמו שצריך. בחירת שיטות pipetting מתאימות במהלך תיכנות מבטיחה מעבר נוזל מוצלח. LLS מאפשר pipetting בלי לקבל פסולת זירז מעומק צינורות נוגדן, שעבורו אנו משתמשים או P50 או טיפים מוליך P200. LLS לא יכול להיות אפשרות טובה עבור טיפי P1000 כמו LLS הוא יותר רגיש עם טיפי P1000 ולפעמים מופעל באופן שקרי על ידי נוכחות של בועות. Heights בהגדרת מעבדתי צריך להיות מותאם עבור כל מכשיר כמו העברת נוזלים הכי מוצלחת יכולה להתרחש, למשל, אם אין מספיק מקום בין קצה של טיפיםוהחלק התחתון של צינורות. כפי שניתן לראות בתרשים 12, אם "קוקטייל Base" ו / או "קוקטייל הפעלה" אינם vortexed טוב, זה עלול לגרום מכתים לא טוב.
חשבנו על השימוש ריאגנטים lyophilized עבור מכתים התא כגישה חלופית להפחית השתנות הקשורות עם מגיב מחלק 19. עם זאת, conjugates הפולימר של צבע הסגול מבריק ידוע אינטראקציה עם כל אותות אחרים הגורמים הלא ספציפיים. ככזה, הוספת יותר משני conjugates פולימר (למשל, BV421 ו BV650 וכו ') ב ריאגנטים lyophilized עלול לגרום איתות שאינם ספציפיים (למשל, עלייה של אות הרקע BV650 ב BV421 + האוכלוסייה) 20. יתר על כן, ריאגנטים lyophilized חסרי גמישות כולל מכתים חדש. הם בדרך כלל יקרים יותר ודורשים צו בתפזורת. מסיבות אלה, בחרנו להשתמש המטפל נוזלי אוטומטי מצויד הצינורות ברקוד 2D. למרות שזה takes הזמן להקים כרוך בהשקעה מראש לרכוש את המכשיר, בטווח ארוך גורם כגון יפוצה על ידי הפרודוקטיביות ואת השחזור של המבחנים מוגברים. למעשה, כמה קבוצות דיווחו על שילובן המוצלח בעבר של המטפל נוזלי אוטומטי לתוך העבודה של immunophenotyping או יישומים דומים שלהם 21,22. פתרונות אוטומטיים לניתוח cytometry זרימה זמינים גם ממקורות מסחריים (III SPA FACS, Workstation הכין קוקטייל אוטומטי ועל FlowStainer). זה עולה עוד יש צורך הגדול להכנת קוקטייל אוטומטי immunophenotyping.
כאשר תשלוט בטכניקה זו, אנו צופים כי ההתפתחות של immunophenotyping דם מלא אוטומטי לחלוטין יהיה לצמצם עוד יותר השתנות ניסוי ל-הניסוי עלול להפוך כל immunophenotyping דם ריאלי אפילו בניסוי קליני רב-מרכזי בקביעת 23. כבר התחלנו באמצעות lyse היהעוזר שעות כדי להפוך את צעדי תמוגה כביסה. כמו כן, אנו צופים כי קביעה אוטומטית של עוצמת הקול של נוגדן הצינורות ברקוד 2D ו המעקב של מחלק מגיב תשפר מלאי מאוד של נוגדנים ואת בקרת איכות על השיטה שלנו, בהתאמה.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
Materials
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
Referenzen
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O’Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
- BD biosciences. . Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
Diesen Artikel zitieren
Koguchi, Y., Gonzalez, I. L., Meeuwsen, T. L., Miller, W. L., Haley, D. P., Tanibata-Branham, A. N., Bahjat, K. S. A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (108), e53485, doi:10.3791/53485 (2016).