Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.
Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate– + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3– + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.
该方法的总的目标是精确地测量用外通量分析细胞的糖酵解速率。使用外酸化糖酵解率的定量测量是许多实验所需的终结点。然而,细胞外酸化的总速率是两个组件的总和:呼吸酸化, 以 CO 2(其水合物至H 2 CO 3,然后离解HCO 3 – + H +)的形式,和糖酵解酸化,在形式乳酸– + H +。
CO 2的总胞外酸化的贡献,直到最近被认为是可以忽略不计在这里使用的测量平台,XF24分析仪7。然而,很明显在该CO 2可以是一个主要贡献者细胞外酸化4-5多个其他系统。多篇论文承认这个骗子tribution,但不要试图二氧化碳直接定量衍生酸3,8,9。我们最近证明了定量的 CO 2的生产是细胞外酸化在这个系统6一个显著源。此外,虽然有生成二氧化碳从葡萄糖分解代谢的多个代谢途径,那些在三羧酸循环进行的矩阵脱氢酶是压倒性的贡献者和所有其他源产生的二氧化碳都在实验误差6的数额。
未经校正的CO 2的产生 ,细胞外酸化因此是糖酵解速率的暧昧指示器和不能定量使用。我们以前的出版物突出了几个实例,其中呼吸的 CO 2包括了大部分的总酸化信号的,即使是在一般认为主要使用糖酵解6个细胞 。此外,该呼吸的 CO 2贡献总酸化常见的代谢分析实验过程中变化很大,这表明在实验的不同部分的糖酵解速率的正确比较需要校正的 CO 2。
为了测量用细胞外酸化的速率细胞的糖酵解速率,有必要pH值的变化转换为所产生的变化总的 H +,并减去所造成的 CO 2的胞外酸化柠檬酸循环的操作过程中释放出来。在这里,我们描述了用于测量细胞外的质子产率(从pH值和细胞外的变化分析培养基的校准缓冲力)和CO 2的生产(从外变化O 2浓度)一个简单的方法,并展示如何计算糖酵解率使用这些测量。
这种方法的力量通过使用它来正确地计算由乳酸产生所限定的糖酵解速率ENS细胞外酸化测量的效用。未经校正的呼吸的 CO 2(或直接测量乳酸),这是不可能,以确定是否和在何种程度上总酸化率反映糖酵解速率,混杂的使用总细胞外酸化作为直接测量乳酸产生的实验解释。
演算
二氧化碳和乳酸是,在实验误差内,仅有的两个贡献者细胞外产酸,是根据实验成肌细胞6。因此,总的细胞外酸化(PPR,质子产率)的速率可被定义为:
PPR TOT = PPR RESP + PPR GLYC 公式1
。_content“>其中TOT =总; RESP =呼吸; GLYC =糖酵解糖酵解PPR这样的:PPR GLYC = PPR TOT – PPR RESP 公式(2)
这里,
PPR TOT = ECAR TOT / BP 公式3
其中ECAR =细胞外酸化率(MPH /分钟),和BP =缓冲功率(MPH /皮摩尔的 H +在7微升),而
PPR RESP =(10 pH值-PK 1 /(1 + 10 pH值-PK 1))(最大值H + / O 2)(OCR TOT – OCR 转/ MYX) 公式4
其中K 1 = CO 2的水化和分解到HCO 3组合平衡常数– + H +;最大H + / O 2 =日ËCO 2来源的酸化为特定的代谢转化,如葡萄糖6完全氧化; OCR =氧消耗速率(皮摩尔O 2 /分钟),和OCR 腐/ MYX =不可线粒体OCR。
方程4株的线粒体的OCR减去任何非线粒体的OCR(定义为OCR是 抗线粒体呼吸毒药鱼藤酮和myxothiazol),占最大的 H +每消耗的O 2的每个基片(最大的 H + / O 2产生 )(见第6),以及二氧化碳从而产生的 H +在实验温度和pH(10 的pH的pK 1 /(1 + 10 的pH的pK 1的比例),对于葡萄糖的充分氧化,线粒体氧消费率(OCR)正好等于CO 2的产率。在细胞外通量测量的密闭测定体积,CO 2的产生D由呼吸仍被困在试验中。大部分的捕获的 CO 2水合至H 2 CO 3,然后离解HCO 3 – + H +。一小部分仍溶解但不能水合,而另一小部分是水合的但不是离解的,如决定热力学由CO 2水合和离解的组合平衡常数来HCO 3 – + H +在实验温度(37℃)和pH值(〜7.4)。
因此,完整的公式计算PPR 克减去PPR RESP从PPR TOT是:
PPR GLYC = ECAR 托特 / BP – (10 的pH的pK 1 /(1 + 10 的pH的pK 1))(最大的 H + / O 2)(OCR托特 – OCR 腐/ MYX) 等式5
一世n这个方式,呼吸和糖酵解,以及它们相关的ATP生产速率的速率,可以定量从简单的测量(耗氧量,外酸化,缓冲能力),以及其他所需的值进口或计算(H + / O 2的决定的P / O和平衡常数K 1)6。这里描述的实验进一步阐述的标准技术,使用细胞外通量分析仪如海马XF24 10,11;其他外通量测量格式 (例如,XFê96,或XFP),低于所有卷应适当缩放。
分析培养基的缓冲功率可以通过构造一个标准曲线的或者直接在细胞外通量平台或单独使用校准pH电极进行测定。在这里,三个选项供外通量测定法中测量缓冲中给出,其中包括使用所有injecti在细胞外通量分析仪无细胞样品井,或者仅使用在井含细胞(第1部分),或通过使用外部pH测量(部分2)在最后一次注射端口的端口。见所附的电子表格例如数据的全部计算。
要使用外流量仪表的pH值检测能力衡量缓冲能力,这是最安全的使用无细胞井,以尽量减少信号变化。然而,误差范围内,无细胞和进行该测量时井含细胞(数据未示出)之间无显着差异存在。注:在步骤1.7中描述的变异进行占通过加入化合物或通过细胞的存在赋予缓冲任何可能的变化,与信号噪声较大的缺点的优点。然而,如上所述,被发现在无细胞之间设计在表1所示的计算出的缓冲功率无显著差异和后实验设计在表2这里所述的实验条件下进行。
另外,过小ΔpH范围(<0.4单位;实验最好限定为0.2单位)中,线性斜率获得通过绘制ΔMPH /皮摩尔H +充分近似于ΔpH和[H +]之间的对数关系。因此该标准曲线的斜率表示了测定培养基的被测的pH /纳摩尔H +缓冲功率在7微升,或在7微升MPH /皮摩尔H +。我们建议增加介质缓冲功率或降低细胞密度超过在测量时间0.2 pH单位变化的样品。测量时间,也可以减少,但是这可能缩短稳态酸化速率和将误差引入的速率计算。
细胞外酸化是细胞代谢率的容易衡量指标。为了正确地确定细胞糖酵解的速率(由乳酸生成定义)关键是要知道的测定培养基的缓冲能力,并可将氧消耗和酸化的胞外通量测量到质子生产率。通过进行该计算,从CO 2释放在柠檬酸循环造成的酸化可被减去,留下所导致乳酸产生的酸化。
这里给出以测量缓冲功率为这种校正的多种不同的方式携带不同的优点和缺点。使用pH探头外部测量是非常准确和可重复的,但可能不反映在由包含在测定板中,测定过程中加入的化合物,或叔的存在内的荧光团引入pH值检测小的差异他细胞本身。内的板的pH测量解决这些问题,还介绍了不同程度的实验噪声。
CO 2的校正ECAR允许首次糖酵解速率的明确的和定量的计算,和一个实验的过程中,揭示了变化,以总ECAR呼吸道和糖酵解的贡献。使用公式5和OCR,ECAR的测量,和缓冲力,糖酵解速率可以使用所提供的简单的电子表格(表6)来计算。此速率可以通过事后乳酸盐测量如果需要6进行验证。在细胞中,其中所述戊糖磷酸途径是高活性的,使用途径抑制剂如6- aminonicotinamide的可能是有用的隔离糖酵解速率。测定和乳酸衍生的 H +从总细胞外酸化速率和氧Consumpt –计算两者的 CO 2的贡献离子率是一个非常重要的工具使用外流量数据来做出关于代谢活性强大的和定量的语句。
使用此处描述的方法,其中包括用于测定缓冲功率,优化外通量实验下调查和所需的数据的单元的各种修改,糖酵解在完整细胞中的速率可以在大范围的实验条件下进行定量。这种方法仅限于细胞,可以在贴壁培养上生长(或细胞或细胞器可以粘附到)的聚苯乙烯表面。当培养的细胞是同质的并汇合它是最可靠的,尽管有用的数据仍然可以在一定范围的这些条件来获得。计算所需要的细胞的代谢的一些知识,作为最大的 H + / O 2的范围是从0.65到1.0的不同基板多为部分氧化6的充分氧化,但是,如果细胞k个nown氧化葡萄糖,可以假定的1.0的值。
虽然有关的所有代谢的表征,此方法可以在系统中使用时是特别有用的,其中呼吸道和糖酵解代谢之间的位移,以保持细胞ATP供给是一个关键的表型,包括干细胞和肿瘤衍生癌细胞的表征。理解这些和其他情况下的代谢控制的改变将允许在实验设计这些细胞类型的分析和更大程度的复杂性和准确性。
The authors have nothing to disclose.
We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).
Pherastar FS | BMG | n/a | microplate reader |
Seahorse XF-24 | Seahorse Bioscience | n/a | extracellular flux instrument |
Seahorse XF assay plate | Seahorse Bioscience | V7-PS | consumable |
XF Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | solution |
HCl standard | Sigma | 38280 | chemical |
oligomycin | Sigma | O4876 | chemical |
FCCP | Sigma | C2920 | chemical |
Rotenone | Sigma | R8875 | chemical |
Myxothiazol | Sigma | T5580 | chemical |
DMEM | Corning | 10-013-CV | medium component |
FBS | Corning | 35-010-CV | medium component |
penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-CI | medium component |
carbonic anhydrase | Sigma | C2624 | chemical |
96-well assay plate | Corning | CLS3991 | consumable |
NAD+ | Sigma | N7004 | chemical |
LDH | Sigma | L1254 | chemical |