-Air bemonsterd Filter Analyse voor endotoxinen en DNA Content
Summary
Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.
Abstract
Outdoor aerosol onderzoek maakt gebruik van algemeen fijn stof bemonsterd filters. Deze procedure kan verschillende karakteristieken van de verzamelde deeltjes wordt parallel uitgevoerd. Het doel van de hier gepresenteerde methode is een zeer nauwkeurige en betrouwbare analyse van de endotoxine en DNA- gehalte van bio-aerosolen onttrokken filters te verkrijgen. De winning van hoogmoleculaire organische moleculen, zoals lipopolysacchariden, van bemonsterde filters omvat het schudden van het monster in een pyrogeen-vrij water gebaseerde medium. De volgende analyse is gebaseerd op een enzymatische reactie die kan worden gedetecteerd met een turbidimetrische meting. Door het hoge gehalte aan organische het bemonsterde filters, wordt de extractie van DNA uit de monsters uitgevoerd met een commerciële DNA extractie kit die oorspronkelijk is ontworpen voor bodems en aangepast aan de DNA opbrengst te verbeteren. De detectie en kwantificering van specifieke microbiële soort, volgens een kwantitatieve polymerasekettingreactie Reactibij analyse (Q-PCR) worden beschreven en vergeleken met andere beschikbare werkwijzen.
Introduction
Air bemonstering van filters is een fundamenteel instrument in atmosferische aërosolen onderzoek. 1 in de steekproef opgenomen filters zijn het uitgangspunt voor diverse chemische, fysische en biologische karakteriseringen van de verzamelde ambient deeltjes. 2-11 Het voordeel van deze aanpak is dat verschillende analyses kunnen worden uitgevoerd off-line op hetzelfde monster. Samenstellen van de gegevens uit de verschillende analyses maakt de onderzoeker een goed begrip van de kenmerken van de verzamelde deeltjes en hulpmiddelen te verkrijgen bij het oplossen van complexe vraagstukken in de atmosferische wetenschappen. 12,13 Bijvoorbeeld, zee- en binnenvaart air-monsters genomen tijdens dezelfde termijn kan worden vergeleken met betrekking tot de bemonsterde deeltjes toxiciteit en biologische samenstelling. 14 voor deze studie, lipopolysacchariden (LPS), onderdelen van gram-negatieve bacteriële celwanden, ook bekend als endotoxinen werden uit filters bemonsterd wal en een binnenzee site, en werden geëvalueerd met behulp van delimulus amoebocyt lysaat (LAL) -test. Daarnaast werd een genomische evaluatie van de bacteriële inhoud (totaal bacteriën, gramnegatieve en cyanobacteriën) werd uitgevoerd op hetzelfde monster met de kwantitatieve polymerasekettingreactie (Q-PCR). De LAL-test is gebaseerd op metingen van troebelheid gevormd na de toevoeging van een waterig extract van amebocytes van de degenkrab, Limulus polyphemus, aan een waterige oplossing die de endotoxinen. Hoe hoger de endotoxine concentratie in het monster, des te sneller vertroebeling ontwikkelt. 15 de Q-PCR-analyse is gebaseerd op een fluorescentiesignaal uitgezonden als een specifiek DNA-fragment wordt geamplificeerd. 16 Bij real time monitoring van het signaal gedurende de exponentiële fase van de PCR reactie en kalibreren met een standaard curve, kan de eerste DNA bedrag worden gekwantificeerd. De combinatie van deze twee analyses samen met anderen, zoals elders beschreven, kan 14 een goede schatting van de niveaus van endotoxine en het verschaffenhoeveelheid van de bron bacteriën in de monsters.
Het doel van de hier gepresenteerde methode is een zeer nauwkeurige en betrouwbare analyse van de endotoxine en DNA- gehalte van bio-aerosolen onttrokken filters te verkrijgen. Terwijl werkwijzen voor bemonstering van de fysische en anorganische chemische eigenschappen van aërosolen zijn welbekend en, meer recentelijk, werkwijzen ontwikkeld om de organische stof component onderzoeken, 17 er weinig onderzoek gedaan naar de biologische component van aërosolen. 18 De reden voor de huidige methode is om deze kloof te pakken door die een gedetailleerd overzicht van een robuuste methode voor het extraheren, analyseren, en het identificeren van de biologische fractie van de lucht aerosolen. 14
De methode die hier beschreven wordt verwacht dat wijdverspreide gebruik vinden in biologische indoor en outdoor aerosol onderzoeksprojecten waarbij filter analyse. 20-24
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk beschrijft de extractie en detectiemethoden voor het kwantificeren van zowel endotoxinen en DNA aanwezig in spuitbussen monsters verzameld op filters. De methoden vereisen nauwkeurige routines en kan gemakkelijk worden uitgevoerd zolang de experimentator hecht aan een paar essentiële en belangrijke punten besproken.
Voor het endotoxine detectiestap op dat de lysaatoplossing vrij viskeus is en neigt om belletjes op pipetteren. Het is moeilijk te verwijderen u bellen, en ze een wijzi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.
Materials
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 – High Air Volume Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203mm X 254mm |
| ELF – Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series – Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 mL |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 Microns | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 microns | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
Referenzen
- Lodge, J. P. J. . Methods of Air Sampling and Analysis. , (1988).
- Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
- Brent, L. C. . Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , (2014).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children’s classrooms. Indoor air. , (2014).
- Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
- Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
- Lodge, J. ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
- Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. . Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. , (2011).
- Vincent, J. H. . Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , (2007).
- Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
- Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
- O’Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
- O’Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
- Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
- Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
- Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
- Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
- Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
- Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
- Guy, D., Hodges, N., Hanlon, G. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. , 12.1-12.15 (2003).
- Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
- Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. . Brock Biology of Microorganisms. , (2011).
- Watson, J. G., Chow, J. C. . Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 591-613 (2011).
- Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
- Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
- Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
- Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
- Kennedy, S. . PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , (2011).
- Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
- Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
