تحليل تصفية عينات الهواء لالسموم الداخلية والمحتوى الحمض النووي
Summary
Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.
Abstract
يستخدم البحوث الهباء في الهواء الطلق عادة المادة الجزيئية عينات على مرشحات. يتيح هذا الإجراء الأوصاف مختلفة من الجزيئات التي تم جمعها لإجراء بالتوازي. والغرض من هذه الطريقة المعروضة هنا هو الحصول على تحليل درجة عالية من الدقة وموثوق بها من الذيفان الداخلي والحمض النووي محتوى-الهباء الجوي الحيوي المستخرج من المرشحات. استخراج جزيئات عالية الوزن الجزيئي العضوية، مثل عديدات سكر شحمية، من المرشحات عينات ينطوي تهز عينة في وسط المياه القائمة خالية من مولد الحمى. ويستند التحليل اللاحق على رد فعل الأنزيمية التي يمكن الكشف عنها باستخدام قياس قياس العكارة. ونتيجة لالمحتوى العضوي عالية على المرشحات عينات، يتم إجراء استخراج الحمض النووي من العينات باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية التي تم تصميمها في الأصل للتربة وتعديلها لتحسين العائد الحمض النووي. كشف وتقدير من الأنواع الميكروبية محددة باستخدام reacti البلمرة المتسلسل الكميفي التحليل (ف-PCR) موصوفة وبالمقارنة مع الطرق الأخرى المتاحة.
Introduction
أخذ عينات من الهواء على مرشحات هي أداة أساسية في البحث الهباء الجوي. 1 المرشحات عينات هي نقطة انطلاق لتحديد خصائص البيولوجية للجسيمات المحيطة جمعت الكيميائية المختلفة، والمادية، و2-11 وميزة هذا النهج هو أن التحليلات المختلفة يمكن أن يكون أجريت خارج الخط على نفس العينة. تجميع البيانات من جميع التحاليل المختلفة تمكن الباحث من الحصول على فهم جيد للخصائص الجسيمات والمساعدات التي تم جمعها في حل المسائل المعقدة في علوم الغلاف الجوي. 12،13 على سبيل المثال،-عينات من الهواء البحرية والداخلية اتخذت خلال نفس فترة يمكن مقارنتها فيما يتعلق سمية الجسيمات عينات وتكوينها البيولوجي. 14 لهذه الدراسة، عديدات سكر شحمية (LPS)، والمكونات على بكتيريا خلية الجدران سلبية الغرام، المعروف أيضا باسم السموم الداخلية، انتزعت من المرشحات عينات على الشاطئ وفي وجرى تقييم موقع الداخلية باستخدامالليمول خلية أميبية الشكل المحللة (LAL) الاختبار. في موازاة ذلك، تقييم الجيني للمحتوى البكتيري (مجموع البكتيريا، سلبية الغرام، والبكتيريا الزرقاء) أجري على نفس العينة باستخدام الكمي تفاعل البلمرة المتسلسل (ف-PCR). ويستند اختبار LAL على قياسات التعكر شكلت بعد إضافة المستخلص المائي من amebocytes من سرطان حدوة الحصان، الليمول بوليفيموس، لمحلول مائي يحتوي على السموم الداخلية. وارتفاع تركيز الذيفان الداخلي في العينة، تطور تعكر أسرع. 15 ويستند التحليل ف-PCR على إشارة مضان المنبعثة كما يتم تضخيمه جزء DNA محددة. 16 من خلال رصد الوقت الحقيقي للإشارة خلال المرحلة الأسية من PCR رد فعل ومعايرة مع منحنى القياسية، وكمية الحمض النووي الأولي يمكن أن يكون كميا. الجمع بين هذين يحلل جنبا إلى جنب مع الآخرين، كما هو مفصل في أي مكان آخر، يمكن أن توفر 14 تقدير جيد من مستويات الذيفان الداخلي وكمية من البكتيريا مصدر في العينات.
والغرض من هذه الطريقة المعروضة هنا هو الحصول على تحليل درجة عالية من الدقة وموثوق بها من الذيفان الداخلي والحمض النووي محتوى-الهباء الجوي الحيوي المستخرج من المرشحات. بينما الأساليب لأخذ عينات من الخصائص الفيزيائية والكيميائية وغير العضوية من الهباء الجوي معروفة جيدا، وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير أساليب التحقيق المكون من المواد العضوية فيها (17) لم يكن هناك بحوث ضئيل على العنصر البيولوجي هباء 18 الأساس المنطقي للتيار طريقة لمعالجة هذه الفجوة من خلال تقديم بالتفصيل وسيلة قوية لاستخراج وتحليل، وتحديد جزء البيولوجي هباء المحمولة جوا (14).
ومن المتوقع أن يجد استخدام واسع النطاق في مشاريع داخلية وخارجية البيولوجية الهباء الجوي البحوث التي تنطوي على تحليل مرشح طريقة تفصيله هنا. 20-24
Protocol
Representative Results
Discussion
This work describes extraction and detection methods for quantifying both endotoxins and DNA present in aerosol samples collected on filters. The methods require accurate routines and can be performed easily as long as the experimentalist adheres to a few essential and important points discussed here.
For the endotoxin detection step, note that the lysate solution is quite viscous and tends to produce bubbles upon pipetting. It is difficult to remove thee bubbles, and they lead to changes in t…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.
Materials
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 – High Air Volume Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203mm X 254mm |
| ELF – Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series – Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 mL |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 Microns | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 microns | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
Referenzen
- Lodge, J. P. J. . Methods of Air Sampling and Analysis. , (1988).
- Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
- Brent, L. C. . Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , (2014).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children’s classrooms. Indoor air. , (2014).
- Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
- Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
- Lodge, J. ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
- Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. . Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. , (2011).
- Vincent, J. H. . Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , (2007).
- Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
- Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
- O’Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
- O’Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
- Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
- Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
- Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
- Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
- Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
- Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
- Guy, D., Hodges, N., Hanlon, G. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. , 12.1-12.15 (2003).
- Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
- Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. . Brock Biology of Microorganisms. , (2011).
- Watson, J. G., Chow, J. C. . Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 591-613 (2011).
- Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
- Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
- Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
- Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
- Kennedy, S. . PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , (2011).
- Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
- Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
