Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS

I fibroblasti sono spesso definiti morfologicamente come cellule fusiformi che aderiscono a substrati plastici. I fibroblasti sono il tipo cellulare principio responsabile per la sintesi e il rimodellamento della matrice extracellulare in embrionali e adulte organi ^1. I fibroblasti sono quindi fondamentali per lo sviluppo dei mammiferi e contribuiscono in maniera sostanziale l'ambiente extracellulare che influenza il comportamento della vicina tipi presenti in ogni tessuto e organo cellulari.

I fibroblasti sono anche il tipo di cellula principale dietro un insieme eterogeneo di condizioni mediche che causano enorme peso clinico. Attività dei fibroblasti patologica ostacola la funzione tessuto normale e comprende tessuti e fibrosi organi (come il polmone e fegato), cicatrici dopo la guarigione della ferita cutanea, arteriosclerosi, sclerosi sistemica, e la formazione di placche ateromatose dopo la lesione dei vasi sanguigni ^2-5. La guarigione delle ferite, in particolare, sia acuta e cronica, coinvolge deposition di tessuto cicatriziale che né assomiglia né funzioni come il tessuto normale circostante, e porta ad una significativa morbilità attraverso diversi stati patologici. Dopo lesioni, vi è una transizione di fibroblasti di miofibroblasti, che poi secernono componenti ECM strutturali, esercitano effetti paracrini sulla vicina tipi cellulari, e ripristinare la stabilità meccanica depositando tessuto cicatriziale ^6.

Nei tessuti cutanei esiste significativa variazione della qualità di riparazione della ferita nel tempo di sviluppo e tra siti anatomici. Nei primi due trimestri di vita del feto guarisce senza lasciare cicatrici; tuttavia, dal terzo trimestre su e tutta l'età adulta, gli esseri umani a guarire con una cicatrice. , Oltre a specifiche età, esistono differenze nella guarigione delle ferite site-specific. Le ferite del cavo orale rimodellare con una minima formazione di cicatrici ^7,8, mentre la deposizione di tessuto cicatriziale all'interno ferite cutanee è significativo ^9. Polemica persiste concerning l'influenza relativa dell'ambiente contro le proprietà intrinseche dei fibroblasti locali sul risultato della guarigione delle ferite per quanto riguarda sia l'età e la posizione ^10,11. Date le differenze significative nella guarigione del mouse orale contro derma cutanee e embrionale prima (E15) vs. dopo embrionale (E18) derma, è probabile che esistono differenze intrinseche nelle popolazioni di fibroblasti a una certa età e di sviluppo tra i vari siti anatomici .

Nel 1986, Harold F. Dvorak postulato tumori sono ferite che non guariscono ^12. Dvorak concluso che i tumori si comportano come ferite nel corpo e inducono loro stroma attivando la cicatrizzazione risposta dell'ospite. Numerosi studi hanno indagato poiché il contributo dei fibroblasti alla progressione dei carcinomi ^13-15, ma come nel caso di guarigione delle ferite, l'identità e l'origine embrionale dei fibroblasti che contribuiscono al compartimento stromale ca cutanearcinomas non è stato adeguatamente definito. La risposta a questa domanda porta rilevanza medica dato recenti studi che denunciano la fibroblasti associati al tumore come un obiettivo potenzialmente efficace per la terapia anti-cancro ^16.

Identificare e prospetticamente isolare i lignaggi di fibroblasti dotati di potenziale fibrogenica in vivo è un passo essenziale verso manipolare efficacemente la loro risposta al danno in una vasta gamma di patologie acute e croniche. Nel 1987, Cormack ha dimostrato due sottopopolazioni di fibroblasti, uno residente nel papillare e uno all'interno del derma reticolare ^17,18. Una terza sottopopolazione è stata trovata associata a follicoli piliferi nella regione papilla dermica del ^19,20 follicolo. Quando coltivate, queste differenze sottotipi di fibroblasti mostrano in un potenziale di crescita, morfologia, e fattore di crescita / citochine Profili ^21-24.

Ad oggi, gli studi esaminando fibroblasti luiterogeneity hanno ampiamente fallito per un'adeguata caratterizzazione diversità evolutiva e funzionale tra fibroblasti in vivo. Questo è, in parte, è il risultato di una dipendenza da popolazioni di fibroblasti in coltura e l'effetto omogeneizzante della coltura cellulare o selezione positiva sulla base di un recettore di superficie sé non espressa da tutti fibroblasti ^25. Un recente studio condotto dal nostro laboratorio ha dimostrato un marcatore di superficie profonda e spostamento trascrizionale in coltura contro fibroblasti incolti isolati dalla metodologia isolamento basato FACS-presentato in questo manoscritto ^26.

Successivamente, abbiamo identificato uno specifico lignaggio fibroblasti nel derma dorsali murine e determinato che questo lignaggio, definita da espressione embrionale engrailed-1, è il primo responsabile per la deposizione di tessuto connettivo nella pelle dorsale. Le funzioni di derivazione durante entrambe le forme acute e croniche di fibrosi tra cui la guarigione delle ferite, cancro formazione stroma, eradiazione indotta fibrosi ^27. La caratterizzazione di linee di fibroblasti distinti ha implicazioni fondamentali per terapie volte a modulare comportamento fibrogenica.

Invece di utilizzare protocolli esistenti che si basano su di manipolazione in vitro per ottenere l'isolamento cellulare ^28,29, il protocollo di raccolta (figura 1) qui descritto aiuterà rendimento analisi informative di fibroblasti che catturano più accuratamente fenotipo e il comportamento in vivo.