Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Os fibroblastos são frequentemente definidas morfologicamente como células fusiformes que aderem aos substratos de plástico. Os fibroblastos são o tipo de célula princípio responsável pela síntese e remodelação da matriz extracelular em embrionárias e adultas órgãos ^1. Os fibroblastos são, portanto, essencial para o desenvolvimento dos mamíferos e contribuir substancialmente para o meio extracelular, que influencia o comportamento do vizinho tipos de células presentes em cada tecido e órgão.

Os fibroblastos são também o tipo de célula principal por trás de um conjunto diversificado de condições médicas que causam enorme fardo clínico. Actividade patológica de fibroblastos prejudica a função do tecido normal e inclui tecido e fibrose dos órgãos (tais como fígado e pulmão), a cicatrização a seguir a cicatrização cutânea da ferida, aterosclerose, esclerose sistémica, e a formação de placas de ateroma após a lesão do vaso sanguíneo ^2-5. Cicatrização de feridas em particular, tanto de forma aguda e crônica, envolve deposition de tecido cicatricial que nem se assemelha nem funções como o tecido normal circundante ele, e leva a morbidade significativa em diversos estados patológicos. Após lesão, existe uma transição de fibroblastos para miofibroblastos, em seguida, que segregam os componentes da ECM estruturais, exercem efeitos parácrinos em tipos de células vizinhas, e restabelecer a estabilidade mecânica através do depósito de tecido cicatricial ^6.

Em tecidos cutâneos existe variação significativa na qualidade de reparação de feridas através do tempo de desenvolvimento e entre os locais anatômicos. Nos dois primeiros trimestres de vida do feto cura sem cicatrizes; No entanto, a partir do terceiro trimestre e em toda a vida adulta, cura dos humanos com uma cicatriz. , Para além específica para a idade, cicatrização de feridas em diferenças existem específica do local. Feridas na cavidade oral remodelar com formação de cicatriz mínima ^7,8, enquanto a deposição de tecido cicatricial dentro de feridas cutâneas é significativa ^9. A controvérsia persiste concerning a influência relativa do ambiente contra as propriedades intrínsecas dos fibroblastos locais sobre os resultados da cicatrização de feridas em relação à idade e localização ^10,11. Dadas as diferenças significativas na cicatrização de rato oral versus derme cutâneas e embrionário antes (E15) vs. depois embrionário (E18) derme, é provável que existem diferenças intrínsecas nas populações de fibroblastos em determinadas idades e de desenvolvimento entre os vários locais anatômicos .

Em 1986, Harold F. Dvorak postulou tumores são feridas que não cicatrizam ^12. Dvorak concluir-se que os tumores se comportam como feridas no corpo e induzir a sua estroma através da activação da ferida resposta do hospedeiro de cura. Numerosos estudos têm investigado uma vez que a contribuição de fibroblastos para a progressão de carcinomas ^13-15, mas, como no caso da cicatrização de feridas, a identidade e origem embrionária dos fibroblastos que contribuem para o compartimento estromal da CA cutânearcinomas não foi adequadamente definido. A resposta a esta questão não tem relevância médica dada estudos recentes expondo a fibroblastos associado ao tumor como um alvo potencialmente eficaz para a terapia anti-câncer ^16.

Identificar e prospectivamente isolar linhagens de fibroblastos dotados de potencial fibrogenic in vivo é um passo essencial para efetivamente manipular sua resposta à lesão através de uma ampla gama de estados agudos e crônicos. Em 1987, Cormack demonstrou duas subpopulações de fibroblastos, uma residindo dentro de uma e a papilar na derme reticular ^17,18. Uma terceira subpopulação foi encontrado associado com folículos pilosos na região papila dérmica do folículo ^19,20. Quando cultivadas, essas diferenças subtipos de fibroblastos apresentam em potencial de crescimento, morfologia e crescimento / fator de citocinas perfis ^21-24.

Até o momento, estudos examinando fibroblastos eleterogeneity pela maior parte não caracterizar adequadamente a diversidade de desenvolvimento e funcional entre fibroblastos in vivo. Isto é, em parte, é um resultado de uma dependência de populações fibroblastos cultivadas e o efeito de homogeneização de cultura de células ou selecção positiva sobre a base de um receptor da superfície da auto não expresso por todos os fibroblastos ^25. Um estudo recente de nosso laboratório demonstraram um marcador de superfície profunda e mudança de transcrição em fibroblastos incultos cultivadas vs. isoladas pela metodologia de isolamento à base de FACS apresentada neste manuscrito ^26.

Subsequentemente, foi identificada uma linhagem de fibroblastos específica no interior da derme dorsal de murino e determinaram que esta linhagem, definida pela expressão embrionária de Engrailed-1, é o principal responsável pela deposição de tecido conjuntivo na pele dorsal. As funções de linhagem durante ambas as formas aguda e crônica da fibrose incluindo a cicatrização de feridas, formação de estroma câncer, eradiação induzida fibrose ^27. A caracterização de linhagens de fibroblastos distintas tem implicações críticas para terapias destinadas a modulação do comportamento fibrogenic.

Ao invés de usar protocolos existentes que se baseiam em manipulação in vitro, para obter o isolamento de células ^28,29, o protocolo de colheita (Figura 1) descrito aqui vai ajudar análises informativos rendimento de fibroblastos que capturam mais precisamente fenótipo e o comportamento in vivo.