鸡小脑切片的体外培养和空间上有针对性的颗粒细胞前体电穿孔

小脑坐在后脑的前端，并负责感觉和运动处理中的成熟大脑的整合以及调节更高的认知过程^1。在哺乳动物和鸟类，它具有一个精心形态并被大量面理化，的祖细胞的广泛过境扩增产物产生超过一半在成人脑的神经元的发育过程中。小脑一直研究的课题的神经生物学家了几个世纪，在分子的时代也同样收到显著的关注。这不仅涉及其固有的吸引生物学，而且这样的事实，它在很大程度上与人类疾病包括发育的遗传性疾病如孤独症谱系障碍^2，最突出的是小脑癌，髓母细胞瘤^3，这是最普遍的儿童脑瘤。重要的是，它是内的wh的优良模型系统非物质文化遗产研究的命运分配和神经大脑发育过程中^4。近年来，它也被确立为大脑发育的比较研究模型系统，由于对整个可见的脊椎动物系统发育^5-10小脑形态的巨大差异。

小脑从菱1在后脑¹¹背侧半开发和发育是由两个主要祖种群，菱形唇缘和脑室区的。周围的后脑的神经上皮的背部区域的菱形唇延伸与屋顶板的边界。它是小脑^12-14的谷氨酸能神经元的兴奋性的发源地。脑室区产生了抑制GABA能神经元的小脑，最突出的是大浦肯野神经元^14,15。后来在发展（约13.5小鼠胚胎天; E6的小鸡^16），谷氨酸培罗成itors从菱形唇沿切线方向迁移，形成祖细胞的软脑膜层：所谓的外部颗粒层（EGL）二级祖区。正是这层经过广泛的过境放大，导致颗粒神经元的数量巨大，在成熟大脑中发现。

增殖在EGL早已被链接到子软脑膜位置而导致的切向迁移从菱形唇^17，与交换机细胞周期出口和祖细胞的神经元分化正在与他们的出口从外EGL层到中间关联EGL ^18。有丝分裂后的颗粒细胞的中间-侧向轴线广泛切线迁移发生在中间和内部的EGL ^19，最终径向迁移进入成熟小脑皮层的内颗粒层之前。从菱形唇在小脑表面细胞的迁移是依赖于CXCL12信号从软^20-22 </sup>和颗粒细胞表达CXCL12受体CXCR4。他们的切向迁移是这样回忆那新皮质切向迁移抑制中间神经元群体^23-25。有趣的是，电子显微镜研究¹⁷表明，EGL细胞增殖形态保持软脑膜接触，连接细胞的行为具有增殖能力的让人联想到哺乳动物的大脑皮层²⁶的基底祖细胞的方式。这反映在EGL的前述分层成三个子层是由不同的胞外环境，并在那里颗粒前体具有不同的基因表达签名^18限定 。

在oEGL祖细胞增殖发生克隆大小正态分布使得当祖单独遗传标记在小鼠胚胎发育的末端，它们产生的有丝分裂后250-500克的中值平均ranule神经^27,28。扩散是依赖于有丝分裂SHH信号来自底层的浦肯野神经元^29-32。向SHH作出反应的能力已被证明是完全依赖于转录因子ATOH1的细胞中自主表达， 在体外³³ 和体内^34,35。同样地，细胞周期出口和分化已被证明是取决于下游转录因子NEUROD1 ^36，这很可能ATOH1 ^37的直接阻遏的表达。

尽管这些进展，并且在解密的细胞周期出口^38-42的细胞生物学的基础相当大的进步，根本的分子机制（S）所依据决定退出细胞周期和从祖过渡到微分神经元，并且在内侧的EGL关联的有丝分裂后的切向迁移以及后来的开关以放射状迁移，仍然不完全理解。这是为了由于EGL的实验棘手的很大程度：它是迟显影，而且很难基因靶向，因为许多相同的神经性分子，可以在颗粒的前体的寿命的关键早些时候在菱形唇。为了解决这个问题，许多作者已经开发出在体内和体外电作为一种方法，目标在啮齿类动物中^43-48产后小脑。在这里，我们率先使用体外电穿孔在小鸡研究EGL，它代表在成本和便利方面相当大的优势。我们的电穿孔和体外切片鸡小脑组织培养的方法使用组织解剖从胚胎第14天的雏鸡在EGL扩散的高峰期。这种方法允许菱形唇的EGL的遗传靶向独立地，将设置了阶段为从颗粒的过渡的遗传解剖祖在有丝分裂后小脑颗粒神经元。