Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (α-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of α-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.
Alfa-synuklein (α-syn) proteinet är rikligt uttrycks främst inom neuroner, och förekommer i ett antal olika former – monomerer, tetramerer, oligomerer och fibriller. Under sjukdom, undergår α-syn konformationsförändringar för att bilda oligomerer och högmolekylära aggregat som tenderar att göra proteinet mer olösliga. Onormalt aggregerade α-syn är en neuropatologiska inslag av Parkinsons sjukdom (PD), Lewykroppsdemens (DLB) och multipel systematrofi (MSA). Biokemisk karakterisering och analys av olösliga a-syn med hjälp av buffertar med ökande tvättmedel styrka och höghastighetsultracentrifugering ger ett kraftfullt verktyg för att bestämma utvecklingen av α-syn patologi i samband med sjukdomsprogression. Detta protokoll beskriver isolering av allt olösligt / aggregerad α-syn från obduktion mänsklig hjärnvävnad. Denna metod kan anpassas med ändringar av studier av normal och onormal α-syn biologi i transgena djurmodeller hyser olika a-syn mutationer liksom i andra neurodegenerativa sjukdomar som presenterar avvikande fibrillära fyndigheter av proteiner som rör deras respektive sjukdomar.
En av de viktigaste patologiska drag gemensamma bland flera neurodegenerativa sjukdomar är bildandet av abnorma proteinaggregat som uppträder i ett protein / sjukdom specifikt sätt ett. Sålunda finns de karakteristiska extraneuronal amyloidbeta plaketter och aggregerade hyperfosforylerat Tau-insättningar inom neuroner vid Alzheimers sjukdom (AD); de aggregerade a-syn insättningar i Lewy Bodies (LBS), som är intraneuronala inneslutningar, och även inom dystrofiska neuronala processer som kallas Lewy neurites (LNS) i PD, PD demens och Lewykroppsdemens (DLBs) 2-4. Onormala a-syn inlåning ska också ses i hallmark lesioner av gliaceller cytoplasmiska inneslutningar i MSA 5. I Huntingtons sjukdom, finns det karaktäristiska Poly-Q inlåning och onormal Tar DNA-bindande protein-43 och smält i sarkom proteiner (FUS) deponeras i frontotemporal demens. Viktigt för PD har α-syn genmutationer befunnits cause autosomalt dominant PD 11/06. Dessutom, α-syn genen tredubbling 12 och dubbelarbete 13 orsakar också familjär PD därmed länka ökad α-syn uttryck åt pathomechanisms av PD. Noterbart är både sporadiska och familjära PD fall hyser onormala fyndigheter av α-syn patologi 14. Nuvarande tillgängliga behandlingar för PS är endast palliativ och har ingen effekt på att stoppa eller fördröja den obevekliga sjukdomsförloppet.
α-syn är rikligt uttryckt i den mänskliga hjärnan och utgör cirka 1% av den totala hjärnproteinet. Det finns mer specifikt inom nervceller, men kan förekomma även i mindre mängder inom gliaceller. En omtvistad punkt är den naturliga strukturen av α-syn som kan existera som en slumpmässig monomer 15 eller som en vikt tetramer 16. Under sjukdom, ändrar α-syn dess konformation som gör det möjligt att få felvikt och denna process tros vara orsaken till sjukdomen pathogeNesis. Trots flera år av undersökningar av patofysiologiska aspekter av α-syn och sjukdom, har de exakta orsakerna till sjukdomsmekanismer förblivit elusive 14.
Studier som använder obduktion analys av Parkinson hjärnor har hittills gett viktiga ledtrådar om normal och onormal biologi α-syn både i sporadisk PD och även PD samband med mutationer i genen LRRK2 17-22. Här har en biokemisk extraktion protokoll (se schema presenteras i figur 1) för alltmer olösliga a-syn-insättningar från humant obduktion PD hjärnvävnad som hyser α-syn aggregat i varierande grad beskrivits. Denna teknik kan även anpassas med modifieringar i buffertkompositioner att studera aggregerade proteiner från andra neurodegenerativa sjukdomar 23,24 och även från transgent djur hjärnvävnad 25-27. Det viktigaste skälet för anpassningar är skillnaderna i solubihet och de totala mängderna av de respektive proteinerna varav somliga har huvudsakligen kärnkraft och kan behöva hög saltbuffertar för optimal extraktion som visas för FUS 28.
Den här artikeln beskriver en biokemisk protokoll för utvinning och undersökning av egenskaper differential löslighetsegenskaper monomera, oligomera och aggregeras α-syn från sjuka hjärnor med hjälp av denaturerings gel driftsförhållanden. Detta är en väl etablerad teknik för att studera aggregerade α-syn 17, 18, 20, 21 ett protein som normalt är lösligt i dess naturliga form, men få amyloidogeniska eller ökad aggregering fastigheter med sjukdomsprogression eller med genetiska mutationer. Icke desto mindre har vissa grupper användes små variationer i SDS-koncentrationer i sina buffertar (8% eller 10% i stället för 5%) 21,22, 30. SDS är en anjonisk detergent och solubiliserar α-syn oligomerer som kan inkludera membranbundna former av α-syn, medan urea, denaturerar ett kaotropiskt reagens de olösliga aggregerade och fibrillära eller amyloidogena former av α-syn 20. I detta avseende en systematisk studie av Paleologou et al 31 undersökte stabilitetenav a-syn oligomerer och fibriller med varierande koncentrationer av urea (6,5-8 M) eller SDS (0,25-2%) och rapporterade att oligomerer stabila i SDS-koncentrationer, men inte med höga koncentrationer av urea. Deras FILA-1-antikropp, specifik för a-syn oligomerer och fibriller upptäcks högre koncentrationer av fibriller vid 6,5 M ureakoncentrationer under icke-denaturerande betingelser. De buffertkoncentrationer som används i detta protokoll avspeglar nära vad som har beskrivits i Culvenor et al., (1999) 32.
De anatomiska delar av hjärnan för biokemisk utvinning av olöslig α-syn bör väljas med omsorg och detta bör återspegla α-syn LB och LN belastning beroende på sjukdomsförloppet 33,34. De fall som används här är basala ganglierna prover från hjärnbarkens och limbiska subtyper av PD återspeglar sent och mellanstadier PD progression enligt McKeith ctriteria 34. På Queen Square Brain Bank, är ena halvan av hjärnanrutinmässigt fixerades i formalin för histokemisk analys och den andra halvan är noggrant dissekeras in i olika anatomiska regioner och frystes och förvarades vid -80 ° C frysar för ytterligare biokemiska och DNA-studier / RNA-analys. Efter formalin fixering av hjärnan och dissektion av neuropathologists är immunohistokemi utförs med hjälp av α-syn antikropp och resultat arkiveras. Också som en rutinprocedur, är pH-värdet i hjärnvävnad mättes vid ankomst som ett mått på agonal tillståndet i hjärnvävnad. Detta utgör en stabil grund för kvaliteten på vävnads bevarande för biokemisk analys.
Våra data här visar att det finns fler SDS lösliga α-syn monomer i PD fall jämfört med kontroller; särskilt hjärnbarkens PD fall har högre α-syn belastning jämfört med det limbiska PD sorten. De hjärnbarkens fall representerar större progression av PD α-syn patologi i hjärnbarkens regioner som cor de främre och övreTices 33,34. De limbiska PD fall har högre LB poäng i den basala framhjärnan / limbiska regioner områden som amygdala, transentorhinal och cingulum regionerna. För meningsfull information och statistisk analys, måste man köra minst 4 fall från varje årskull. Likaså vi inte har försökt statistisk analys av data blot presenteras här.
Det skall också noteras att olika antikroppar kan känna igen olika blanketter / sammansättningen av högre ordning a-syn oligomerer och var och en kan ha sin egen relativa känsligheten och preferens. Detta framgår av resultaten av Tong et al. 29, där de visar att 4 olika a-syn antikroppar (Syn-1, SS, Onco och LB509) ger utbytbara resultat åtminstone för a-syn oligomerer / aggregat. De α-syn monomerer erkändes på liknande grad av alla 4-antikroppar även om dessa kan ha variationer beroende på om α-syn antikroppsepitop är belägen antingen i den N-terminala eller Cterminal 29. Likaså specifika antikroppar för fosfo-alfa synuklein bestämma distinkt hög molekylvikt α-synuklein arter 20,21. I det protokoll som beskrivs här, har i hög grad kännetecknas antikropp Syn-1 använts 19-21.
Emellertid är det viktigt att överväga validera alla nya antikroppen på western blöts genom antikropps förabsorption experiment och även överuttryck och knockdown av proteinet i cellerna.
Det är viktigt att överväga andra variationer som har tillämpats av forskare för att bestämma mindre fragment av a-syn och eller instabila tetra a-syn former. Detta skulle kunna omfatta mild fixering av membran med 0,4% PFA i PBS för att behålla stympade former av α-syn 35 eller behandling av provhomogenat med tvärbindare för att stabilisera tetramers 36.
Exakt biokemisk utvärdering av proteiner med användning av post mortem tissue kräver minimering av enzymatisk proteinnedbrytning och modifiering. Det är därför lämpligt att använda vävnad med de kortaste obduktions förseningar och / eller välj matchade prover inom fall årskullar. Immunohistokemi med användning av standard antikroppar för α-syn immunohistokemi bör utföras före start av isolering protokollet. Omfattningen av α-syn-patologi är mycket varierande och kan variera beroende på regioner valda. Det är lämpligt att välja regioner med riklig patologi som en positiv kontroll för optimalt utbyte med varje körning. Användningen av proteasinhibitorer och om nödvändigt fosfatasinhibitorer att förhindra oönskad enzymatisk nedbrytning efter frisättning av intracellulära proteaser eller fosfataser förekommer under cell-lys och upprätthållande av proverna vid 4 ° C är avgörande.
Det är viktigt att alla prover inom partiet experiment hanteras jämnt och konsekvent för att undvika inom användar variationer; multipel freeze-upptiningscykler bör undvikas eftersom detta potentiellt kan dra tillbaka posttranslationella modifieringar såsom fosforylering. En kritisk punkt att tänka på när man undersöker ett stort antal prover är att data från immunoblottar bör normaliseras till ett prov, som skall löpa parallellt med alla andra prover på geler och all data refererade till det provet. Detta görs för att säkerställa normalisering av immunoblot data mellan flera blöts. Detta är den metod som i vår senaste undersökning 22.
Det bör noteras att för att hålla bakgrunden ECL låg, blottarna bör inte tillåtas att torka ut när som helst under Western blot-protokollet. Dessutom bör mycket långa exponeringstider (> 10 min) på autoradiografi filmer undvikas eftersom detta kommer att leda till mättnad av ECL signal och kommer att leda till felaktiga kvantifiering.
Denna ovanstående protokoll är en relativt enkel teknik som använder vanliga laboratoriereagens och iinstrument och kan vara ett värdefullt verktyg för att undersöka patofysiologi α-syn protein i PD forskning. Denna metod kan inte bara utökas med lämpliga ändringar i studiet av α-syn biologi a-syn transgena djur, men även andra neurodegenerativa sjukdomar som presenterar abnorma avlagringar av aggregerade proteiner såsom AD, MSA, DLB, HD och frontotemporaldementias. Men västra blot uppgifter som beskrivs här kan också valideras med hjälp av enzymkopplade immunosorbentanalyser användning av antikroppar för specifika former av α-syn 31.
The authors have nothing to disclose.
I thank Dr Adamantios Mamais for extracting α-synuclein from human tissue and running of blots. This work was supported in part by a MRC Grant (MR/L010933/1) and in part by the Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) to the UK Parkinson’s Disease Consortium (UKPDC) whose members are from the UCL Institute of Neurology, the University of Sheffield and the MRC Protein Phosphorylation Unit at the University of Dundee. RB received funding from MJFox foundation for this work and is also funded by the Reta Lila Weston Trust.
Tris-HCL | Sigma | T5912 | |
sodium chloride | VWR | 27800.291 | |
SDS | Fluka | 71727 | |
Urea | Sigma | U5378 | |
Protease inhibitor tablets | Roche | 04 693 116001 | |
Phosphatase inhibitor tablets | Roche | 04 906 837001 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma | P4417 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
NuPAGE MOPS SDS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
NuPAGE transfer buffer | Invitrogen | NP0006-1 | |
Hybond-P membrane | GE Healthcare | RPN303F | |
Whatman 3MM filter paper | Sigma | WHA30306185 | |
Bis-tris gels 4-12% | Invitrogen | NP0322BOX | |
Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
Bio-RAD DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | |
Thickwall Beckman Polycarbonate tubes | Beckman | 355630 | |
Western blot stripping buffer | Thermo scientific | 46430 | |
Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 610786 | |
beta-actin primary antibody (mouse monoclonal | Sigma | A5441 | |
HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody | Santa Cruz | sc-2031 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
Instrument | Company | Rotor/ model no | |
Benchtop Ultracentrifuge Optima Max | Beckman | MLA-80 | |
Sonicator | Heat Systems | XL20-20 | |
Homogeniser | Jenke and Kunkel | TP18/10 |