파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

사후 뇌 조직은 신경 질환에 대한 여왕 광장 뇌 은행에 기증, 런던 대학, 윤리적으로 승인 된 프로토콜을 사용하여 신경 연구소 인체 조직 기관에서 발급 라이선스에 따라 연구를위한 저장 (HTA) 영국 (NO. 12198). 이 프로토콜 (표 1)에 사용되는 경우의 목록을 참조하십시오. 버퍼 1. 준비 1X TBS (트리스 완충 식염수) 버퍼를 준비합니다 500 mM 트리스 – 염산 pH 7.4의 1,500 밀리미터의 NaCl과 원액으로 10 배 TBS를 준비합니다. 밖으로 60.5 g의 트리스 – CL 산도 7.6 및 고순도 물 800 ㎖ 중의 염화나트륨 87.6 g의 무게. 1 M 염산으로 pH를 조정하고 1 L.에 최종 재고 볼륨을 증류수 스톡을 10 배 희석하여 1X TBS의 최종 농도를 준비한다. 추가 단백질 분해 효소 억제제 (PI), (50 ㎖ 버퍼 당 1 정제) 및 PHOS 스톱 포스 파타 아제 억제제 정 (1 정 버퍼 ml의 10 당)에프로테아제 및 포스파타제의 비 특정 효소 활동의 효과를 폐지. 참고 : 여기에서 우리는 제조업체의 지침에 따라 사용할 수 있습니다 로슈에서 정제하지만 똑같이 다른 상업적으로 이용 가능한 억제제 억제제 효소를 사용하고 있습니다. (PH 7.4) 1X TBS에 / 나트륨 V 도데 실 설페이트 (SDS) 승 버퍼를 5 %를 추가하여 TBS-SDS 버퍼를 준비합니다. SDS를 가용화 자기 교반기를 사용하여 일정한 교반과 함께 60 ℃로 용액을 가열한다. 8 M / TBS-1X SDS 버퍼 V w (PH 7.4)의 최종 농도로 우레아를 첨가하여 TBS-SDS 우레아 버퍼를 준비한다. 우레아를 용해 교반기 일정한 교반과 함께 60 ℃로 용액을 가열한다. 2. 샘플 균질화 및 차등 초 원심 분리 주 : 작업의 다음 부분 HTA UK의 규칙들에 따라 인간의 뇌 조직의 처리를 포함한다. 지역 표준 운영 절차는 모든 TI에 따른다MES. 뇌 시료는 부압 유지 microcabinet 균질화 동결 뇌 조직 블록 재료 해부된다. 일회용 가운 장갑, 얼굴 마스크, 오버 신발 보호 및 안전 고글 절차 전반에 걸쳐 착용. 인체 조직의 폐기물은 안전 처리를위한 20 분 동안 121 ℃에서 고온 가압 멸균 후 폐기됩니다. 샤프 (메스 블레이드) 봉쇄 및 안전한 폐기를위한 적절한 날카로운 컨테이너에 배치된다. (기저핵 지역에서 무게가 약 0.5 g)을 냉동 인간 조직의 덩어리를 타고 빠르게 작은 페트리 접시 및 멸균 메스 블레이드를 사용하여 얼음에 작은 조각 (약 1 ㎜ × 2)로 말하다. 각 샘플에 대한 별도의 배양 접시와 메스 블레이드를 사용합니다. 15 ML 튜브에 다진 조직을 수집하고 튜브에 얼음처럼 차가운 1XTBS 버퍼의 10 권을 추가합니다. 10 초 동안 20,000 rpm에서 기계적 균질기를 사용하여 샘​​플을 균질화. 2 분 동안 얼음에 냉각. 이 단계에서 세 시간을 반복에스. 주 : 균질화 동안 샘플 가열되지 않도록이 행해진 다. 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 명확히. 비 균질 재료의 펠렛을 폐기하십시오. 상층 액 (원유 균질)를 가지고, (튜브의 크기는 로터의 크기에 따라 달라집니다) 원심 분리기 튜브 폴리 카보네이트 조심스럽게 균형을 추가 할 수 있습니다. 4 ℃에서 1 시간 동안 100,000 XG에 원심 분리기. 이 TBS 분획 그대로 뜨는을 유지. 워시는 4 ℃에서 15 분 동안 10 만 XG에 1X TBS 버퍼와 원심 분리기마다의 5 권에 두 번 펠렛. 상층 액을 버린다. 실온에서 1X TBS-SDS의 약 5 볼륨에서 20 kHz에서 10 초 동안 펠렛을 초음파 처리하여 최종 펠렛을 재현 탁. 주 : SDS 함유 완충액 샘플 첨가 SDS 침전을 방지하기 위해 10 ℃에서 가져온되어야 전에. 25 ° C에서 30 분 동안 10 만 XG에 초 원심 분리기. 이 일 같이 뜨는 유지전자는 가용성 분획을 SDS. 워시 실온에서 1X TBS-SDS 버퍼의 두 번에 5 볼륨을 펠렛. 원심 분리기 25 ° C에서 15 분 동안 10 만 XG에 때마다. 완전한 용해를 달성하기 위해 10 초 동안 20 kHz로 설정 초음파기를 사용하여 1X TBS-SDS 우레아 완충액 50 μL에 최종 펠렛을 용해; 이것은 우레아 가용성 분획으로 불린다. 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 함량에 대한 각각의 분획을 분석. 단백질 분석 시약과의 호환성을 허용하는 1X TBS 완충액으로 1 : SDS-TBS 우레아 샘플 1 희석. -80 ° C에서 작은 분액 (20 μL)에 동결 샘플을 동결 – 해동 사이클을 감소시킨다. 주의 : 샘플을 10 % 글리세롤을 추가하면 -80 ° C에서 장기간 저장을 위해 권장된다. 샘플 및 분석 결과 3. 면역 블 롯팅 10 웰 4~12% 비스 – 트리스 폴리 아크릴 아미드 겔에 TBS, TBS-SDS와 TBS-SDS-우레아 추출물에서 실행 샘플표준 기술을 사용하여 버퍼를 실행하는 것과 함께 MOPS. 참조 갤러거와 Chakravarti (2008)에 대한 자세한 서양 얼룩 프로토콜 (29). TBS와 SDS 및 요소 분획에 대한 분자량 마커와 함께 각 레인 위에로드 각 샘플에서 단백질의 10 μg의를. 1 시간 동안 또는 로딩 버퍼로부터 청색 염료 겔의 바닥에 도달 할 때까지 200 V에서 젤을 실행. 전기 영동 나일론 막 (28)에 젤에서 단백질을 이동, 20 % 메탄올을 포함하는 전송 버퍼에 처음으로 100 % 메탄올 다음 사전 젖은. 단백질 측과 분자량 크기 마커의 방향을 결정하기 위해 오점에 식별 표시를 제공한다. 젖은 종이 필터와 함께 막과 젤 샌드위치. 멤브레인의 정확한 위치는 겔과 양극 사이에 분리막으로 중요하다. V. 40에서 2 시간 동안 전송을 수행 1X PBS-트윈 (1X PBS-T) 버퍼 메이크업 : 200 ml의 PBS에 1 정을 녹여물은 0.01 M 인산염 완충액, 0.0027 M 염화칼륨 및 0.137 M 염화나트륨, pH가 7.4을 얻었다. 70 rpm으로 진탕하면서 30 분 동안 1X PBS-T에서 5 % BSA 용액을 차단하는 멤브레인. 이 막에 차 항체의 결합 비특이적을 방지 할 수 있습니다. (1X PBS-T와 세척 일련의 뒤에 (4 ° C에서 O / N) (750) 희석 : 1에서, α-SYN 차 항체 SYN-1 (마우스 단일 클론 항체 BD 바이오 사이언스) 6 mL를 단백질 얼룩을 프로브 3 × 5 분마다) 28. 1 차 항체 결합 된 적절한 HRP와 얼룩을 품어 : 2,000 희석을 30 분 동안. 1X PBS-T와 세척 일련의 (3 × 5 분마다)을 수행합니다. 어두운 방에 15 초 동안 강화 된 화학 발광 솔루션의 말을 담근다. 빛 증거 카세트 단백질면이 위로와 얼룩에 대한 집착 필름과 장소자가 방사선 필름과 커버 말은 적절한 신호 (적절한 크기의 밴드)를 촬영합니다. 자동화 된 개발자의자가 방사선 필름을 개발합니다. 참고 : 오도 자동화 개발 기계를 사용할 수없는 경우에는 상용 소스 개발자와 해결사를 사용하여 수동으로 개발 될 수있다. 웨스턴 블롯 6 ml의 상수 α-SYN 항체 신호의 얼룩을 제거하기 위해 진탕 10 분 동안 버퍼를 제거하여 웨스턴 블롯을 품어. 8,000 희석 : 1에서 베타 – 액틴 차 항체 (마우스 단일 클론)을 사용하여 3.6.2에 이르기까지 단계 3.43를 수행합니다. 검사 및 정량을 위해 NIH ImageJ에 (무료로 다운로드 할 수있는 소프트웨어)를 사용하여 TIFF 이미지 및 측정 밀도에 최종 이미지를 변환 할 수 있습니다. 주 : 소프트웨어가 관심의 상대 영역 (적절한 크기의 밴드)의 밀도의 판독이 가능하고, 데이터가 하나의 임의 단위 또는 α-SYN 밀도 / β 액틴 (하우스 키핑 유전자)의 비율로 표현 될 수있다 집 유지 유전자 (우레아 – 가용성 샘플의 경우에서와 같이) 유효하지 않은 경우 자신. </li>