Mess Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie
Summary
We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.
Abstract
Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 °C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.
Introduction
Der Eintrag von Influenza-A-Virus (IAV) ist ein mehrstufiges Verfahren, das mit der Bindung des Virus an Rezeptoren auf der Plasmamembran von Zielzellen 1 beginnt. Der Rezeptor für die IAV Sialinsäure, die auf einer Vielzahl von Glykoproteinen und Glykolipiden vorliegt. Das Hämagglutinin (HA) Proteins der IAV, die in der Virushülle vorhanden ist bindet an Sialinsäure und vermittelt so die Befestigung der viralen Partikel in der Plasmamembran von Zielzellen 2. Das Virus tritt in die Zellen über Clathrin-vermittelte Endozytose, sondern auch alternative Eintrittswege wie Makropinozytose, beschrieben worden, 3-6. Die Wechselwirkung zwischen HA und Sialinsäure ausreichend erscheint zum Vermitteln sowohl Befestigung und Auslösen Internalisierung von Viruspartikeln 7 sein. Dennoch alternative Eingabe Rezeptoren wurden vorgeschlagen und ihre Rollen in IAV Eintrag werden derzeit untersucht 1,8,9.
CurBeauty Preis werden Anstrengungen unternommen, um Wirtsfaktoren, die im viralen Lebenszyklus mit dem Ziel der Entwicklung von dringend benötigten neuen antiviralen Therapien 10-12 beteiligt sind, zu identifizieren. Virus Eintrag würde eine günstige Schritt für die Ausrichtung IAV Wachstum, um eine virale Infektion in seinen frühesten Zeitpunkt zu blockieren. Mess verschiedenen Stadien der IAV Eintrag experimentell ist anspruchsvoll wie in der Regel große Mengen des Virus erforderlich sind, um eingehende Virus zu erkennen. Zusätzlich kann der Erfassungsbereich für Änderungen in den Eintritt des Virus ist nur linear durch das Fehlen der viralen Replikation. Dies unterstreicht die Notwendigkeit von Tests mit hoher Empfindlichkeit.
Der Test wir hier erlaubt den Nachweis gebunden Virus an der Zelloberfläche als auch internalisiert Nachweis von Viren in Bezug auf die Gesamtmenge der Zell-assoziierten Virus. Die Verwendung von biotinylierten Wildtyp-Virus ermöglicht die bequeme Messung durch Färbung mit STV-Cy3 und Auslesen mittels Durchflusszytometrie. Biotinylierte Virus ist kalt gebunden an Zells, um die Befestigung zu ermöglichen, sondern verhindern, Internalisierung von Viruspartikeln. Die Zellen können fixiert werden, permeabilisiert und mit STV-Cy3 gefärbt, um die angeschlossenen Virus zu messen. Das Signal von extrazellulären, befestigt Virionen können aufgehoben werden, wenn ein Blockierungsschritt vor der Fixierung in dem die Zellen mit nicht-markiertem Streptavidin (STV) inkubiert aufgetragen. In einem nächsten Schritt, nach Bindung von biotinyliertem IAV, Temperatur wird auf 37 ° C verschoben und Internalisierung von viralen Partikeln stattfinden darf. Internalisierten Partikel von Bindung von STV dadurch die Unterscheidung zwischen extra- und intrazellulärer Viren so geschützt.
Pro Versuchsbedingung werden vier Proben erforderlich: '0 min ": Die erste Probe, bezeichnet mit" 0 min "zu kalt gebundenen Virus an der Zelloberfläche zu messen. '0 min + STV': Die zweite Probe, '0 min + STV' markiert sind, gibt die Basissignalintensität des Experiments. Befestigt Virus blockiert with STV und das Signal nach Färbung mit STV-Cy3 sollte viel niedriger im Vergleich zu den "0 min" Probe sein. '30 Min ": Die dritte Probe, '30 min 'enthält befestigt und internalisiert Virus infolge der Temperaturverschiebung auf 37 & deg; C für 30 min. '30 Min + STV ': Die vierte Probe, '30 min + STV "Maßnahmen der intrazelluläre Anteil von Viren. STV Blockierungsschritt nach dem 30 min Inkubationszeit aufgetragen. Als Ergebnis werden Viruspartikel an der Zelloberfläche durch STV wobei nur internalisiert Viren zur Verfügung Färbung mit STV-Cy3 gebunden. Die relative Menge internalisiert Virus kann als das Verhältnis der internalisierten Virus (im '30 min + STV 'gemessene Probe) dividiert durch die Gesamtvirusmenge (von der '30 min beschriebenen "Probe) berechnet werden.
Als Kontrollen schlagen wir vor, mock-infizierten Zellen enthalten. Das Signal nach STV-Cy3-Färbung von mock-infizierten Zellen gibt den Hintergrunddie sich aus dem Färbungsprotokoll. Eine Steuerung für IAV Befestigung ist die Vorbehandlung von Zellen mit bakteriellen Neuraminidase (NA). NA abspaltet Sialinsäure von zellulären Glykoproteine, wodurch Befestigungs Rezeptoren von der Zelloberfläche zu entfernen. Natriumazid (SA) ist ein potenter Inhibitor metabolischen und dadurch blockiert Endozytose 13. Zellen mit Natriumazid sollte positiv für Virusbindung, aber negativ für die Internalisierung sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unser Protokoll beschreibt eine einfache Möglichkeit zur Messung der Virus-Bindung und Internalisierung durch Durchflusszytometrie. Es erlaubt die Verwendung von markierten Wildtyp-Virus, das imitiert enger Virus-Infektionen im Vergleich zur Verwendung von virusähnlichen Partikeln (VLP). Während unsere Protokoll wurde optimiert, um Bindung und Internalisierung von IAV messen, kann es leicht für andere Viren angepasst werden. Darüber hinaus, wie Durchflusszytometrie ist zum Auslesen verwendet, aufeinander Färbungen…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Schweizerischen Nationalfonds (31003A_135278) SST unterstützt. MOP ist der Begünstigte einer Promotionsstipendium der AXA Forschungsfonds. Wir bedanken uns bei Patricia Nigg für die Hilfe bei der Gestaltung der Figur 1.
Materials
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
Referenzen
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virolog. 2, (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
- Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
- Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
- Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
- Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
- Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
- Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
- Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
- Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
- Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Macey, M. G., Macey, M. G. . Flow Cytometry Principles and Applications. , (2007).
- Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).
