In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
Tijdens de embryonale ontwikkeling, weefsels en organen morfogenese plaatsvinden door middel van een nauwkeurig programma dat in termen van celproliferatie, migratie en lineage specificatie 1-4 kunnen worden beschreven. Deze biologische processen zijn betrokken bij het handhaven van volwassen weefsel homeostase, hetwelk stamcel regeneratie. Lineage tracing, de identificatie en opsporing van de nakomelingen van een specifiek type cel populatie, levert een belangrijk instrument voor het bestuderen van embryogenese en stamcel homeostase. Inderdaad wordt steeds vaker gebruikt in vele gebieden van onderzoek. Bijzonder, lineage tracing werd een essentieel hulpmiddel bij het identificeren van de oorsprong en het lot van de stamcellen in homeostase en de ontwikkeling van kanker. Dit is omdat het essentiële informatie over de cel gedraagt in het kader van het intacte weefsel of organisme, met minimale experimentele interventie verschaffen, in tegenstelling tot cel isolatie en in vitro kweek of TransplantatieOp die kunnen leiden tot ongewenste vertekening.
Traditioneel kleurstoffen zoals vetoplosbare carbocyanine die integreren in het plasmamembraan van cellen, werden gebruikt voor lineage tracing. Hoewel deze soorten experimenten succes hebben geleid tot belangrijke ontdekkingen en gevormde rudimentaire concepten ontwikkelingsbiologie 5,6, ze hebben een aantal beperkingen, zoals de moeilijkheid om de specificiteit van doelcellen controle, het ongewenste effect van de kleurstof op celgedrag en de verdunning van het label in de tijd. Nucleotideanalogon etikettering benaderingen zijn ingeschakeld documenteren van het bestaan van slow-cycling "label behoud van cellen" die vermoedelijk overeen met stamcellen 7,8 rusttoestand. Hoewel deze techniek de aanwezigheid van langzaam delende cellen op basis van proliferatie kinetiek gedurende een beperkte tijdsperiode konden aantonen kon geen wezenlijke inzicht over de functionaliteit van stamcellen. Een optimale lineage tracing methdologie dient het effect van etikettering op de eigenschappen van de gemarkeerde cellen, het nageslacht of de buren te minimaliseren. Bovendien zou het gunstig zijn om controle op het etiket inductie, namelijk de mogelijkheid om de celpopulatie label per fase en tijdsafhankelijke wijze als in een enkele cel (klonale) te vervullen. Een stabiele en onomkeerbare labeling methode die wordt doorgegeven aan alle nakomelingen van de cel grondlegger van belang dat het etiket in de tijd worden vastgehouden en niet naar naburige cellen.
Recentelijk genetische benaderingen cel labeling ontwikkeld. In deze systemen kunnen celspecifieke promoters worden gebruikt voor Cre recombinase expressie activeren teneinde een loxP-geflankeerd wegversperring de expressie van reportergenen te verwijderen en zoals groen fluorescent eiwit of Β-galactosidase reporter genen 9-13. Deze benadering maakt niet alleen het volgen van cellen en hun nageslacht, maar maakt ook celolation en moleculaire karakterisatie. Cell volgen op enkele cel niveau werd mogelijk door inductie van de expressie van een fluorescente reporter gen. Een belangrijke beperking van dit systeem is dat slechts bij zeer lage percentage van cellen gemerkt is het mogelijk om te scheiden en traceren individuele klonen. Om deze beperking veelkleurige reporters kan worden overwonnen. Bij het gebruik van multicolor etikettering, kan het volgen van differentiële lot van naburige cellen in dezelfde niche efficiënt 14-17 worden bereikt. Recentelijk diverse Brainbow (Br) allelen werden ontwikkeld voor lineage tracing experimenten, waardoor een stochastische expressie van meerdere fluorescente reporter genen met gebruikmaking van de Cre / lox-systeem. De Cre / lox-systeem bestaat uit het Cre recombinase enzym dat herkent en bindt aan specifieke DNA-sequenties zoals loxP sites. Na de binding van Cre recombinase, plaatsspecifieke recombinatie, waardoor het verwijderen van sequenties loxP geflankeerd resulting willekeurige expressie van verschillende fluorescerende eiwitten (het mechanisme wordt hieronder beschreven). Een verscheidenheid van Br lijnen zijn beschikbaar voor gebruik (zie reviews 16,18,19). De belangrijkste verschillen tussen de Br stammen omvatten (i) verschillen in het aantal fluorescerende genen in de cassette, variërend van 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) tot 4 (Br1.1, Br2.1) fluorescent genen (ii) de aanwezigheid van wederzijds georiënteerd lox locaties aan gen inversie (Br2.0-2.1) maken, (iii) het soort gebruikte lox plaatsen, en (iv) de expressie of stilte van fluorescente genexpressie vóór Cre activatie. Het onlangs gevestigde Br3 biedt een verbeterde werkwijze voor meerkleurige beeldvorming van neuronen. Een van de belangrijkste kenmerken van deze transcriptie is dat het een nieuwe reeks van fotostabiele gefarnesyleerde fluorescerende eiwitten, die een nog kleuring van de fijnste neuronale processen 20 mogelijk te maken bevat.
Belangrijk is, kunnen verschillende versies van Br cassettes neuronale specifieke bevatten Thy1 promoter of alomtegenwoordig tot expressie CAG (CMV) promoter. Tenslotte, terwijl sommige van de Br transgene muizen kan een enkele Br transgen bevatten, andere kunnen bestaan uit meerdere transgene kopieën, waardoor de productie van een enorm aantal mogelijkheden om kleurcombinaties uit te drukken in elke cel (zie bijvoorbeeld 16).
In onze studie gebruikten we de R26R-Confetti muis die de Br 2,1 cassette 21 bevat. Br2.1 is speciaal ontworpen om Cre-gemedieerde DNA inversies en niet alleen uitsnijdingen vanwege de onderlinge oriëntatie van de loxP-plaatsen (figuur 1) mogelijk maken. Zo kunnen deze inversie / uitsnijding gebeurtenissen die leiden tot kleurverandering zolang Cre huidige 16 blijven. Daarom een induceerbare Cre tijdelijke expressiesysteem is essentieel voor betrouwbare cell tracking behulp Br2.1. In figuur. 1, de Br2.1 bevat een alomtegenwoordige CAG promotor gevolgd door loxP geflankeerd Neo R -cassette, die fungeert als een transcriptionele wegversperring, die wordt gevolgd door 4 fluorescerende reporter genen coderend voor groen (GFP), geel (YFP), rood (RFP) en cyaan (CFP) fluorescerende eiwitten, gelegen in twee tandems. Geen fluorescentie wordt vóór Cre activatie expressie. Inductie van Cre recombinase veroorzaakt het verwijderen van de neo-R cassette waarvan de willekeurige expressie van één van de 4 fluorescerende eiwitten in een bepaalde cel. Het eerste segment bevat loxP-geflankeerd GFP en een omgekeerde YFP, terwijl het tweede segment bevat loxP-geflankeerd RFP en een omgekeerde CFP. Deze DNA-segmenten kunnen continu worden geïnverteerd (via loxP dat in omgekeerde richting), of uitgesneden, zolang Cre recombinase aanwezig is. Daarom moet een voorbijgaand en gecontroleerd Cre transgene gebruikt. De Br2.1 cassette biedt een uitstekend systeem voor het onderscheid tussen overlappende uitstoot op signaal locatie: de uitdrukking van YFP en RFP is cytoplasma, de GFP is kernenergie en het GVB is gebonden aan het celmembraan. GFPen RFP emissies worden gemakkelijk gescheiden door conventionele fluorescentiemicroscopie. Om YFP / GFP / CFP emissie scheiden, wordt een spectrale confocale beeldvormingssysteem nodig. Al met al, de Br2.1 cassette maakt de willekeurige, induceerbare, en weefsel specifieke expressie van één van de vier verschillende fluorescerende genen in elke gerichte cel. In feite, wanneer een groter aantal kleurcombinaties nodig, kan homozygote muizen die 2 allelen van Br2.1 in voorkomen, hetgeen resulteert in de expressie van 2 kleurenmarkeringen voor elke cel en het verhogen van het aantal mogelijke kleurencombinaties 10 22. Enkele Br muizenstammen mogelijk de expressie van een veel groter aantal mogelijke kleurencombinaties sinds meerdere kopieën van de cassette geïntegreerd in hun genoom 16. Maar in de meeste gevallen, de vier kleurencombinaties die door één Br2.1 allel volstaan. Volgens het protocol hier verschaft, kan men deze methode tot stand met behulp van een relatief eenvoudige opzet van spectral microscopie met weinig of geen noodzaak tot kalibratie.
Hier geven we een aanpasbare protocol voor het gebruik van de R26R confetti-muizen die één Br2.1 allel bevatten, lineage tracing experimenten van het hoornvliesepitheel. Deze transgene muizenstam is gebruikt voor het bestuderen van de oorsprong en bestemming van de colon 21,23 en corneale epitheliale stamcellen 22,24, de aanwezigheid van stamcellen activiteit darmkanker 25 en voor het karakteriseren nieren podocyte bij focale segmentale glomerulosclerose (FSGS) 17.
Lineage tracing experimenten zijn uitgevoerd voor vele jaren. De recente technologische verbeteringen en de opkomst van de Confetti muizenstammen opende nieuwe mogelijkheden voor onderzoek. Tegenwoordig kunnen onderzoekers profiteren van een groot aantal commercieel verkrijgbare weefsel-specifieke Cre lijnen knockout muizen en transgene muizen. Dit biedt de mogelijkheid voor het ontwerpen van veelzijdige experimentele systemen voor de aanpak van wetenschappelijke vragen met elementaire kennis, het vermijden van moeizame praktijk, terwijl het verstrekken van robuuste en betrouwbare gegevens.
R26R-Confetti muizen een elegant middel voor efficiënte tracking en bestuderen van de aard en het gedrag van cellen in een levend organisme. Het systeem is eenvoudig vast te stellen en geeft niet-invasieve stam traceren van afzonderlijke cellen gedurende embryogenese stamcel regeneratie onder homeostase, of onder verschillende omstandigheden, zoals letsel, ontsteking en kanker. De verkregen data biedt een robuuste description van het voortbestaan van gerichte cellen, klonale cel expansie en cel migratie, in een meetbare manier. Een kritische stap is om de juiste genetische muizenstam die met zekerheid kan toestaan weefselspecifieke efficiënte labeling op een bepaald ontwikkelingsstadium te kiezen. Een beperking van dit systeem is dat voor het bewaken van een levend organisme, weefsel toegankelijk en transparant moeten zijn. Evenzo volgen van een dikke weefsel in een levend dier kan alleen worden vergemakkelijkt door twee-foton of meerdere foton microscopie. Echter, cell tracking is mogelijk postmortem weefselsecties en misschien intact weefsel worden onderzocht nadat deze is getransformeerd door de transparante CLARITY werkwijze 32,33 te worden. Een andere beperking te worden beschouwd is dat hoewel aangrenzende cellen die dezelfde fluorofoor expressie waarschijnlijk tot dezelfde klonale lijn, is het mogelijk dat zij kunnen worden verkregen uit onafhankelijke celoorsprong die willekeurig expressie dezelfde fluorescerende gen. Dit possibility wordt zeer waarschijnlijk bij het gebruik van meerdere Br allelen tal van kleurencombinaties mogelijk te maken.
In de toekomst, het combineren van de Confetti-systeem met de beschikbare genetische instrumenten (dwz, knockout, knockin en transgene muismodellen) zal de studie van de genen en hun mutaties in gezondheid en pathologie toe. Ook lineage tracing systeem onder verschillende storingen (dwz stamcel niche vernietiging, laser gemedieerde cel ablatie, behandeling met geneesmiddelen) zal nieuwe inzichten brengen op de betrokkenheid van de signaalwegen in de cel beslissingen over het lot. Uiteindelijk is de combinatorische gebruik van fluorescerende en bioluminescentie etikettering, genetische verslaggevers van signaalwegen en geavanceerde microscopie zullen onderzoekers van een robuust systeem om te leren hoe enkele cellen reageren op hun omgeving in hun eigen omgeving.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |