Gelişmiş Darkfield Mikroskopi ve Hiperspektral Haritalama ile histolojik Örneklerinde Metal Oksit Nanopartiküller Kimlik
Summary
Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Abstract
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Introduction
Nanomalzemeler giderek sanayi ve çeşitli uygulamalar kullanılır, daha hızlı, ekonomik ve böyle elektron mikroskobu gibi geleneksel yöntemlerine daha uygundur nano görüntüleme ve karakterizasyon yöntemlere ihtiyaç vardır. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi 1 ve toplam iç yansıma (TIR) ya da sıfıra yaklaşır olarak kaybolan alan bazlı yaklaşımlar dahil olmak üzere birçok optik teknikler istihdam edilmiştir hücre, doku ve canlı sistemlerin, ile nanoparçacık (NP) etkileşimleri için görselleştirmek Alan Tarama optik mikroskopi (NSOM) 2,3. Ancak bu çoğu uzman olmayan laboratuarları 4 ulaşamayacağı high-end analitik yaklaşımlar vardır. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) da dahil olmak üzere elektron mikroskobu, aynı zamanda hücrelerin 5,6,7,8 ile NP etkileşimi incelemek için kullanılır olmuştur. Yüksek açılı halka şeklindeki karanlık alan (HAADF) taramalı transmisyon elektron mikroskopisi NPS etkileşimini incelemek için kullanılır olmuşturvirüs 9. Mikroskopisi NP-hücre etkileşimleri 10 incelemek için kullanılan bir başka popüler bir tekniktir.
Son yıllarda, karanlık alan bazlı hiperspektral görüntüleme (SHE) teknikleri biyolojik matrisler 11 NPs çalışmak için gelecek vaat eden bir analitik araç olarak kullanılmıştır. HSI sistemleri hiperküp ya datacube 12 olarak bilinen konumsal ve spektrum verileri, bir üç boyutlu bir temsilini üretir. Spektral varyasyon mekansal harita malzemesi tanımlanması için kullanılır. Bilinen malzemelerin spektral profil oluşturulur ve bilinmeyen numunelerin ile karşılaştırma yapmak için, referans kütüphaneleri olarak kullanılır. HSI sistemleriyle en önemli avantajlarından biri, böylece bilinen, benzer kompozisyon başka referans parçacık bağlayarak yanı sıra ya da ex vivo in vivo konumu ve bilinmeyen NPS dağılımını kuran spektroskopi ile görüntüleme birleştirmek için onun yeteneği olduğunu.
Birçok avantajı vardırgeleneksel görüntüleme teknikleri üzerinde HSI sistemleri kullanılarak: minimum numune hazırlama gereklidir; örnek hazırlama doğada genellikle tahribatsız; görüntü toplama ve analiz hızlıdır; teknik, düşük maliyetli 13 olduğu; ve karışık bileşimin ve / veya karmaşık matrisler bileşiklerin uzamsal dağılımı ve analiz daha kolay 14 gerçekleştirilir.
Değerli örnekleri içeren nanomateryal araştırma için en önemli hususlar biri potansiyel art arda bir veya birden fazla yöntemlerle örnekleri incelemek için izin veren bir tahribatsız görüntüleme yöntemi, mevcudiyetidir. Tekrarlanan veya birden analizler tek bir yöntemle temin olmaz kapsamlı veri setlerini geliştirilmesi arzu edilebilir. Bu bağlamda için, optik özelliklerini inceleyerek numuneyi analiz etmek en güvenli yoludur. Gelişmiş bir karanlık alan mikroskobu (EDFM) ve HSI sistemi kullanılarak örneğin optik tepkisini incelemek için – yani reflectance, aynı zamanda absorbans ve transmitans – özelliği, kimlik ve karakterizasyonu 15 gerçekleştirilebilir. Potansiyel karakterizasyon uç noktalar göreli büyüklüğü ve numune içindeki nanopartiküller veya aglomera ve nanopartiküllerin dağılımının şekli bir değerlendirmesini içermektedir.
Bu yazıda, bir spektral açı eşleyicisi (SAM) olarak ifade edilen bir piksel eşleme spektral algoritmasına dayalı bir HSI sistemi kullanılarak ölüm sonrası dokuda metal oksit nanopartiküller için spesifik eşleme yöntemleri tarif eder. Bu hayvan modelleri mühendislik nanomateryallerin maruziyetin sağlık etkilerini değerlendirmek için kullanılır, burada in vivo Nanotoksikoloji araştırma, güncel ve geleceğe tamamlayacak potansiyele sahip çünkü bu özel uygulamaya seçti. Bu yöntemin uygulanması, aynı zamanda, doku ya da hayvan modelleri kullanan nano ölçekli ilaç verme araştırmayı olabilir. O boyunca, özellikle nano partıkuler emilim, dağılım, metabolizma ve atılım olarakrgans ve dokuların bu sistem ile incelenebilir. Geniş uygulama çeşitli biyomedikal araştırmalar 11 kullanılmak için araştırılmaktadır.
Bu yöntem, elementel bileşimler 16-19 çeşitli nanopartiküller maruz kalan (örneğin, çeşitli dokuların türleri, bronkoalveolar lavaj örnekleri, kan smear) farklı biyolojik numunelerin değerlendirilmesi için de kullanılabilir. Bundan başka, bu yöntem, in vivo ve nano ölçekli ilaç verme çalışmaları 11 için ilgili olan, in vitro, in nanopartikül biodistribution araştırılması için de faydalıdıdr. Biyolojik numuneler ötesinde, EDFM ve HSI örneğin atık su 20 çevre numuneleri içinde nano-tanecikleri değerlendirmek için de kullanılabilir. O nanoparçacık penetrasyonu önlemede kişisel koruyucu donanımların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir çünkü Mesleki maruziyet değerlendirmesi, hem de bu tekniğin kullanılması ile sağlanabilir. Ayrıca, araştırma team şu anda mesleki maruziyet değerlendirmelerinin toplanan nanopartiküller filtre medya örneklerinin değerlendirilmesi için benzer bir EDFM ve HSI protokolünü geliştirmektedir. EDFM ve HSI bu farklı örnek tiplerinin hazırlanması değişebilir olmakla birlikte, bunlar kolaylıkla optik sistem tarafından görüntülenmiştir edilebilir şekilde hazırlanır önemlidir. Geleneksel aydınlık mikroskobu ile görüntülenmiştir eğer Tipik olarak, örnek hazırlanmalıdır. 11 piyasada mevcut birçok hiperspektral görüntüleme sistemleri vardır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geleneksel histolojik lekeleme, metal oksit nanopartiküllerinin belirlenmesini ve analiz geçirmiş doku örnekleri EDFM, HSI haritalama ve görüntü analiz teknikleri bir kombinasyonu ile elde edilebilir için. Bu örnekler uygun görselleştirme için 5-10 um kalınlığında kesitlere ayrıldı edilmesi önemlidir, histoloji ve imünohistokimya için numune hazırlamada esneklik (leke tipi, örneğin, sabit ya da dondurulmuş dokuları kullanılarak) varken. Burada kullanılan örnekler hematoksilin ve eosin ile boyanmış ve dakika, cam mikroskop lamları üzerine monte edilmiş, formalin ile sabitlenmiş ve parafine gömülmüş önce 6 um kalınlığında bir döner mikrotom kesit edildi. Bir ex vivo deri penetrasyon toksikoloji işbirliğinden domuz deri dokuları, bu çalışma için kullanıldı. Dokuların sulu süspansiyonlarda, metal oksit nanopartiküllerinin (alüminyum oksit, silis, seryum oksit) maruz bırakıldı. Ilgi bölgesi (ler) in tespiti (yüksek kontrast elemeNTS) EDFM ile müteakip HSI haritalama ve analiz kolaylaştıran önemli bir ilk adımdır. Pozitif ve negatif kontrol örnekleri görüntülü ve başvuru için bir spektral kütüphane oluşturmak amacıyla ilk analiz edilmelidir. Pozitif kontrol toplanan spektrumları bir pozitif kontrol spektral kütüphane ihraç edilmektedir. Daha sonra, negatif kontrol görüntülerden bütün spektrumlar özgüllüğünün geliştirilmesi için pozitif kontrol spektral kütüphanesinden çıkarılır (yanlış pozitif azaltmak için). Elde edilen filtre spektral kütüphanesi olan söz konusu malzemelerin analizi için karşılık vermektedir RSL olarak kabul edilir. Tüm doku örnekleri aynı görüntüleme sürecinden geçmeleri ve RSL karşı eşleştirilir. Ortaya çıkan görüntü siyah arka plan üzerinde ilgi unsurları ile tek alanlar içerecektir. Bu görüntü daha sonra ImageJ görüş alanı başına eşlenmiş parçacıkların alanı elde etmek onun eşik ve parçacık analizi fonksiyonları kullanılarak analiz edilebilir. ImageJ elde edilen sayısal veri ihracat olabilirdaha fazla analiz için bir elektronik tabloya ed.
Bu biyolojik örnekler birbirlerinden doğal farklıdır ve boyama yöntemleri EDFM ve HSI aracılığıyla görselleştirme etkileyebilir olarak, pozlama ayarları numunenin belirli bir tip için en yüksek kontrastlı görüntü üretir ne uygun olarak belirlenmesi gerektiğini dikkate almak önemlidir. Yanlış pozitif azaltılması spektral kütüphanelerin filtrasyon yoluyla elde edilebilmesine rağmen, bu kirlenmeye karşı gelen spektrumları potansiyel olumlu denetimin spektral kütüphanesinden filtrelenmiş olabilir gibi, bu ilgi elemanı ile kirlenmesini kaçınmışlardır güvenilir negatif kontroller elde etmek için önemlidir yanlış negatif oranlarının artırılması. Sp üretmek biriken parçacıkların yüksek sayıda alanları: Ayrıca, hiperspektral görüntüleme yazılımı ile saptanabilir spektrum yoğunluğu aralığı, belirli yazılım sınırını aşmak olamaz (Bu çalışma için, yani 16.000 adettir)yoğunluk sınırının üzerinde ectral yoğunluklarının yanlış negatif sayısının artması riskine karşı, spektral kütüphane dışına bırakılır.
HSI sistemi, geleneksel yöntemlere göre birçok avantaj sağladığını da, dikkate alınması gereken bazı dezavantajları ve sınırlamalar vardır. Biri büyük işlem gücü gerekebilir toplanan optik veri büyük miktar. Başka bir referans spektral kütüphaneler oluşturulan edilirken HSI, özellikle başlangıç aşamalarında, zaman yoğun olabilir olduğunu. Ayrıca, görüntüleme süresi, basit karanlık alan görüntüleme olmadığı kadar yavaş yapım, görüntü yakalama başına birkaç dakika gerekebilir; Ancak, yine de elektron mikroskobu ile numune alma hazırlığı ve görselleştirme gerçekleştirmek daha hızlıdır. Ayrıca, karmaşık sistemler son derece uzmanlaşmış kontrollerin geliştirilmesini gerektirmektedir ve 26 zorlu standart, evrensel bir referans kütüphanelerinin kurulması yapmak çoklu karakteristik spektrumları, neden olabilir. Son olarak, teknolojiBireysel atomları çözebilirsiniz gibi atomik kuvvet mikroskobu veya transmisyon elektron mikroskopisi olarak probe- veya elektron mikroskopi teknikleri, daha düşük çözünürlükte nique sonuçları. Bu tekniğin çözünürlüğü nedeniyle nanometre düzeyinde veya hassas bir alt mikron seviyesinde malzemelerin bulmak için partikül boyutlarını ölçmek için yüksek hassasiyetli aracı olmaktan önler onun fotonik doğası, sınırlıdır. Teknik, bazı doku bölmeleri veya hücresel organel içindeki parçacıkları saptamak mümkün olsa da (örneğin hücre çekirdekleri gibi) 1'den büyük um, küçük organelleri veya özellikler bu yöntemle doğru görselleştirmek için zorlamaktadır. Ayrıca kendi uzamsal çözünürlük verilen notun, bir, bu yöntem tek nanopartiküller ve aglomeralarla 11 arasında ayırt edemiyor.
Diğer hususlar şunlardır: (böyle asil metaller gibi) bazı malzemeler daha kolay analı yapabilirsiniz, hangi çok daha yüksek yansıtma ve farklı spektral profilleri varze ve bu araç ile Işıksal haritası. Bu tür yarı-metalik araştırıldı oksitler ve karbon bazlı nano 24, 27, gibi diğer nedeniyle temel bileşikler şekline daha zor olabilir, ve matris bağlı olabilir. Tarafından Mercer ve ark., Iki fare soluma çalışmalarında, bu çalışmada kullanılan birine benzer bir sistem akciğer ve çevre dokuların ile son derece yüksek kontrastlı dayalı ikincil organlarda karbon nanotüpler bulmak amacıyla kullanılmıştır. Karbon fiberlerin benzersiz şekli tanımlanması için yeterli bir özelliği olduğu için ancak hiperspektral haritalama, her iki çalışmada da olasılıkla gösterilmemiştir. Normal biyofizik süreçlerle belirli organları ilgilendiren nanopartiküller yatırılması (ve genellikle kendisi çalışmanın konusu) öngörülemeyen olduğundan, uygulanabilir bir pozitif kontrol belirlenmesi zor olabilir ve kontrol m nasıl nesil göz önüne alınmasını gerektirir: Başka bir göz dokularında özellikle ilgilidirilgi konusu bir malzeme durumunu etkilemez uş. Spektral kütüphane ilgi bozulmamış nanopartiküller oluşturulur Örneğin, nedeniyle değişiklik nedeniyle, örneğin parçacık (değişmesi sonucu spektrumları değişikliklere dokuların veya hücrelerin bu aynı nanopartiküller kütüphaneyi eşleme zor olabilir pH, çözünme, aglomerasyon, protein bağlama) ve genel mikroçevresinin veya matris. Son olarak, teknik olarak yarı-kantitatif doğada sınırlıdır: sadece kolay bir malzemenin toplam organı yükünü karakterize gibi görevleri yerine getirmek için kullanılabilir anlamına gelir içindeki çözünürlüğü, diğer iki boyutlu mikroskopi teknikleri gibi nicel olabilir.
Genel olarak, EDFM ve HSI, TEM, HAADF ve DIC gibi geleneksel nano malzeme görüntüleme ve karakterizasyon teknikleri, oranla birkaç avantaj sağlamaktadır. EDFM / HSI daha yoğun konvansiyonel kıyasla zaman ve maliyet tasarrufu daha hızlı görüntü elde etme ve analizi için izin verirtional teknikleri. Buna ek olarak, EDFM / HSI için numune hazırlanması zaman kazandırır ve daha sonra diğer teknikler kullanılabilir çünkü bu da belirli bir örnek daha esnek analizi için izin veren, genellikle en az tahribatsız hem de. Bundan başka, bir çok HSI bileşimlerin nano ölçekli maddelerin analizi için matrislerin çeşitli sağlayan çok yönlüdür. Araştırma ekibi teknolojisinin özgüllük derinlemesine bir değerlendirmesi dahil diğer malzemeler ve örnek türleri için burada anlatılan yöntemi geliştirmek için çalışıyor. Araştırma ekibi tarafından soruşturma altında eleştirel bir sonraki adım, geleneksel altın standartlarına karşı bu tekniklerin doğrulama (örneğin, Raman, TEM, SEM) malzeme ve ilgi doku tipleri için.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
Materials
| CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
| Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
| Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
| CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
| cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
| cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
| type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
| 70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
| metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |
Referenzen
- Sun, W., et al. Endocytosis of a single mesoporous silica nanoparticle into a human lung cancer cell observed by differential interference contrast microscopy. Anal Bioanal Che. 391 (6), 2119-2125 (2008).
- Anselme, K., et al. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomate. 6 (10), 3824-3846 (2010).
- Anshup, A., et al. Growth of gold nanoparticles in human cells. Langmui. 21 (25), 11562-11567 (2005).
- Weinkauf, H., et al. Enhanced dark field microscopy for rapid artifact free detection of nanoparticle binding to Candida albicans cells and hyphae. Biotechnol. 4 (6), 871-879 (2009).
- Sondi, I., et al. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E coli as a model for Gram negative bacteria. J Colloid Interface Sc. 275 (1), 177-182 (2004).
- Berry, C. C. Possible exploitation of magnetic nanoparticle cell interaction for biomedical applications. J Mater Chem. 15 (5), 543-547 (2005).
- Chithrani, B. D., et al. Elucidating the mechanism of cellular uptake and removal of protein coated gold nanoparticles of different sizes and shapes. Nano Lett. 7 (6), 1542-1550 (2007).
- Chithrani, B. D., et al. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6 (4), 662-668 (2006).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV 1. J Nanobiotechnol. 3 (6), 1-10 (2005).
- Carlson, C., et al. Unique cellular interaction of silver nanoparticles size dependent generation of reactive oxygen species. J Phys Chem. 112 (43), 13608-13619 (2008).
- Roth, G. A., et al. Hyperspectral microscopy as an analytical tool for nanomaterials. WIREs Nanomed Nanobiotechnol In Press. , (2015).
- Williams, P., et al. Maize kernel hardness classification by near infrared (NIR) hyperspectral imaging and multivariate data analysis. Anal Chim Act. 653 (2), 121-130 (2009).
- Ziph Schatzberg, L. Hyperspectral imaging enables industrial applications. Industrial Photonic. , (2014).
- Sun, D. W. . Hyperspectral imaging for food quality analysis and contro. , (2010).
- ElMasry, G., et al. Hyperspectral imaging for nondestructive determination of some quality attributes for strawberry. J Food En. 81 (1), 98-107 (2007).
- Mortimer, M., et al. Potential of hyperspectral imaging microscopy for semi quantitative analysis of nanoparticle uptake by protozoa. Environ Sci Techno. 48, 8760-8767 (2014).
- Sarlo, K., et al. Tissue distribution of 20 nm 100 nm and 1000 nm fluorescent polystyrene latex nanospheres following acute systemic or acute and repeat airway exposure in the rat. Toxico. 263, 117-126 (2009).
- Husain, M., et al. Pulmonary instillation of low doses of titanium dioxide nanoparticles in mice leads to particle retention and gene expression changes in the absence of inflammation. Toxicol Appl Pharmacol. 269, 250-262 (2013).
- Meyer, J. N., et al. Intracellular uptake and associated toxicity of silver nanoparticles in Caenorhabditis elegan. Aquatic Toxicol. 100, 140-150 (2010).
- Badireddy, A. R., et al. characterization and abundance of engineered nanoparticles in complex waters by hyperspectral imagery with enhanced darkfield microscopy. Environ Sci Technol. 46 (18), 10081-10088 (2012).
- Dettmeyer, R. F. . Staining techniques and microscopy Forensic histopathology fundamentals and perspectives. , 370 (2011).
- Titford, M. Progress in the development of microscopical techniques for diagnostic pathology. J Histotechnol. 32 (1), 9-19 (2009).
- Kumar, G. L. . Special stains and H&E. , (2014).
- Manolakis, D., et al. Hyperspectral image processing for automatic target detection applications. Lincoln Laboratory Journal. 14 (1), 79-116 (2003).
- Mercer, R. R., et al. Pulmonary fibrotic response to aspiration of multi walled carbon nanotubes. Part Fibre Toxicol. 8 (1), 21 (2011).
- Kim, M. S., et al. Hyperspectral reflectance and fluorescence imaging system for food quality and safety. T Am Soc Ag En. 44 (3), 721-730 (2001).
- Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Part Fibre Toxico. 10 (1), 38 (2013).
