향상된 암시 야 현미경 및 초 분광 매핑하여 조직 학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자의 식별
Summary
Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Abstract
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Introduction
나노 물질이 점점 산업 및 다양한 용도에 사용되는 바와 같이, 더 신속한 저렴 및 전자 현미경과 같은 기존의 양상,보다 편리 나노 이미징 및 특성화 방법이 필요하다. 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경 (1) 및 내부 전반사 (TIR) 또는 근 등 산장 기반 접근 방식을 포함하여 많은 광학 기술이 채용 된 세포, 조직 및 생활 시스템과 나노 입자 (NP)의 상호 작용을 시각화 필드 주사 광학 현미경 (NSOM) 2,3. 그러나 이러한 대부분의 비 전문 연구소 4의 손이 닿지 않는 곳에 하이 엔드 분석 접근 방식이다. 투과 전자 현미경 (TEM)을 포함하여 전자 현미경은 또한 세포와 5,6,7,8- NP 상호 작용을 연구하는데 사용되었다. 높은 각도 환형 암시 야 (HAADF) 주사 투과형 전자 현미경 된 NP의 상호 작용을 연구하기 위해 사용되어왔다바이러스 9. 공 초점 현미경 NP-세포 상호 작용 (10)을 연구하는 데 또 다른 인기있는 기술이다.
최근, 암시 야 계 초 분광 영상 (HSI) 기술은 생물학적 매트릭스 11 NPS를 연구하기위한 유망한 분석 도구로서 사용되어왔다. HSI 시스템 또는 하이퍼 큐브 datacube 12라고도 공간 및 스펙트럼 데이터의 3 차원 표현을 생성한다. 스펙트럼 변동 공간지도 소재 식별을 위해 사용된다. 공지 된 재료의 스펙트럼 프로파일이 생성 미지 시료에 비교 참조 라이브러리로서 사용될 수있다. HSI 시스템과 주요 이점 중 하나는 이에 의해 공지 된 유사한 조성물의 다른 기준 입자에 이들과 결합뿐만 아니라 또는 생체 생체 내 위치 알려지지 된 NP의 분포를 확립 분광법으로 촬상을 결합 할 수있는 능력이다.
여러 장점이 있습니다종래의 이미징 기술 위에 HSI 시스템을 사용 : 최소 샘플 준비가 요구된다; 시료 준비는 자연에서 일반적으로 비파괴; 이미지 수집 및 분석은 빠르다; 기술은 비용 효율적인 13이고; 혼합 된 조성물 및 / 또는 복잡한 매트릭스의 화합물의 공간 분포 분석은보다 쉽게 14 달성된다.
귀금속 나노 물질을 포함하는 샘플의 연구를위한 가장 중요한 고려 사항 중 하나는 잠재적 반복 하나 이상의 방법에 의해 시료를 검사 할 수있는 비파괴 이미징 법의 유용성이다. 반복 또는 복수의 분석은 하나의 방법에서 사용하지 못할 것입니다 포괄적 인 데이터 세트를 개발하는 것이 바람직 할 수있다. 이러한 측면에, 그 광학 특성을 연구하는 샘플을 분석하는 안전한 방법이다. 향상된 암시 야 현미경 (EDFM)와 HSI 시스템을 사용하여 샘플의 광학 응답을 연구 – 즉 reflectance뿐만 아니라, 흡광도 및 투과율 – 기능 식별 및 특성은 15을 행할 수있다. 잠재적 인 특성 엔드 포인트는 상대적인 크기와 샘플 내에서 나노 입자 또는 덩어리와 나노 입자의 분포의 모양에 대한 평가를 포함한다.
본 논문에서는 스펙트럼 각도 맵퍼 (SAM)로 지칭 화소 스펙트럼 매치 알고리즘을 기반 HSI 시스템을 이용하여 사후 조직에서 금속 산화물 나노 입자에 대한 구체적 매핑 방법을 설명한다. 이 동물 모델은 나노 물질에 대한 노출의 건강 영향을 평가하는 데 사용되는 것을 특징으로하는 생체 나노 독성학 연구에서 현재와 미래를 보완 할 수있는 잠재력을 가지고 있기 때문에 우리는이 특정 응용 프로그램을 선택했다. 이 방법의 응용 프로그램은 또한 조직 또는 동물 모델을 이용하여 나노 약물 전달 연구를 알릴 수있다. O에 걸쳐 특히, 나노 입자의 흡수, 분포, 대사, 배설에rgans와 조직이 시스템을 조사 할 수있다. 애플리케이션의 다양한 생물 의학 연구 (11)에서 사용하기 위해 연구되고있다.
이 방법은 원소 조성물 16-19의 다양한 나노 입자에 노출되어 (예컨대 다양한 조직 유형, 기관지 폐포 세척액 시료 및 혈액 도말 같은) 상이한 생물학적 시료의 평가에 이용 될 수있다. 또한,이 방법은 생체 내에서와 나노 약물 전달 연구 (11)에 대한 관련입니다 체외에서 나노 입자의 생체 분포를 연구하는 데 유용합니다. 생물학적 시료 넘어 EDFM 및 HSI는 폐수 20 환경 시료에서 나노 입자를 평가할 수있다. 이 나노 입자의 침입을 방지 개인 보호 장비의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있기 때문에, 작업장 노출 평가는 물론이 기술의 사용에 의해 촉진 될 수있다. 또한, 연구 테오전 현재 직업적 노출 평가에서 수집 된 나노 입자의 필터 미디어 샘플의 평가 및 유사 EDFM HSI 프로토콜을 개발하고있다. EDFM HSI 및 이러한 다른 종류의 시료 준비는 다를 수 있지만, 그들이 쉽게 광학계에 의해 가시화 될 수있는 방식으로 제조하는 것이 중요하다. 그것은 전통적인 시야 현미경을 통해 가시화 될 것처럼 일반적 시료로한다. (11) 시판의 하이퍼 스펙트 럴 여러 이미징 시스템이있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
종래의 조직 학적 염색법, 금속 산화물 나노 입자의 식별 및 분석을받은 조직 샘플은 EDFM, HSI 매핑, 및 영상 분석 기술들의 조합을 통해 달성 될 수있다 들어. 그것은 샘플 최적 시각화 50-10 ㎛의 두께로 절단하는 것이 중요하다; 조직학 또는 면역 조직 샘플 준비 유연성 (얼룩의 타입 등, 고정 또는 고정 된 조직을 사용하여)이 존재한다. 여기에 사용 된 시료를 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색하고 coverslipped, 유리 현미경 슬라이드에 장착, 포르말린 고정 파라핀 이전 6 ㎛의 두께로 회전하는 마이크로톰으로 절편을했다. 생체 외 피부 침투 독성 협력에서 돼지 피부 조직은 본 연구에 사용 하였다. 조직은 수성 현탁액에서 금속 산화물 나노 입자 (알루미나, 실리카, 세리아)에 노출시켰다. 관심 영역 (들)의 검출 (고 대비 eleme국세청) EDFM 후속 HSI 매핑 및 분석을 용이하게하는 중요한 첫 번째 단계입니다. 양성 및 음성 대조군 샘플 이미징 및 참조 용 스펙트럼 라이브러리를 만들기 위해 먼저 분석해야한다. 양성 대조군에서 수집 된 스펙트럼은 양성 대조군 스펙트럼 라이브러리에 수출하고 있습니다. 그리고, 음의 제어 화상의 모든 스펙트럼 특이성을 개선하기 위하여 양성 대조군의 스펙트럼 라이브러리로부터 감산된다 (위양성을 감소). 결과 필터링 스펙트럼 라이브러리는 관심 물질의 분석을 위해 제공하는 RSL 간주됩니다. 모든 조직 샘플은 동일 화상 형성 공정을 거치며 RSL 대해 매핑된다. 결과 이미지는 검은 배경 위에 관심의 요소와 영역 만 포함됩니다. 이 이미지는 다음 ImageJ에 시야 당 매핑 입자의 영역을 획득하기 위해 임계 값과 입자 분석 기능을 사용하여 분석 될 수있다. ImageJ에 얻은 수치 데이터를 수출 할 수있다추가 분석을 위해 스프레드 시트로 에드.
이는 생물학적 시료가 서로 본질적으로 다르며, 염색 방법 EDFM과 HSI 통해 시각화에 영향을 미칠 수 있으므로, 노출 설정은 시료의 특정 유형에 대한 가장 높은 콘트라스트 이미지를 생성하는 것에 따라 결정되어야 함을 고려하는 것이 중요하다. 오탐 (false positive)의 감소가 스펙트럼 라이브러리를 여과를 통해 달성 될 수 있지만,이 오염에 대응하는 스펙트럼 잠재적 양성 대조군의 스펙트럼 라이브러리에서 필터링 될 수 있으므로, 그것은, 관심있는 요소의 오염을 회피 한 신뢰성있는 음성 대조군을 얻기 위해 매우 중요 , 위음성 율을 증가시킨다. SP를 생성 축적 된 입자의 수가 높은 영역 : 또한, 하이퍼 스펙트 럴 이미징 소프트웨어와 검출 가능한 스펙트럼 강도 범위가 특정 소프트웨어의 한계 능가 없다 (본 연구를위한, 즉 16000 단위이다)강도 한도 이상의 ectral 강도 인해 위음성의 수를 증가의 위험, 스펙트럼 라이브러리에서 제외된다.
HSI 시스템은 기존의 방법에 비해 많은 장점을 부여하지만, 고려해야 할 몇 가지 단점과 한계가 있습니다. 하나는 상당한 컴퓨팅 성능을 요구할 수의 수집 된 광 데이터 다량있다. 또 다른 기준 스펙트럼 라이브러리가 생성 될 때 HSI는 특히 초기 단계에서 시간이 많이 될 수 있다는 것이다. 또한, 촬영 시간은 간단한 암시 야 영상보다가 느리게 만들고, 이미지 캡처 당 몇 분을 필요로 할 수있다 그러나, 여전히 전자 현미경에 의해 샘플 준비 및 시각화를 수행하는 것보다 더 빠르다. 또한, 복잡한 시스템은 매우 전문화 제어의 개발을 필요로하고 26 어려운 표준화 보편적 기준 라이브러리의 구축을 여러 특성 스펙트럼을 초래할 수있다. 최종적으로, 첨단개별 원자를 해결할 수있는 등의 원자력 현미경 또는 투과 전자 현미경과 같은 프로브 – 또는 전자 현미경 기법보다 낮은 해상도에서 nique 결과. 이 기술의 해상도로 인해 나노 미터 수준에서 정확하게 또는 서브 미크론 수준에서 물질을 찾기위한 입자 크기를 측정하기위한 고정밀 공구 할 수없는 성질의 광자, 제한된다. 기술은 특정 조직 구획 또는 세포 소기관 내에서 입자를 정확하게 지적 할 수 있지만 (예 : 세포 핵 등)보다 1 ㎛, 작은 세포 기관 또는 기능은이 방법으로 정확하게 시각화하기 위해 도전하고 있습니다. 또한 공간 해상도 주어진 참고,의,이 방법은 단일 나노 입자 덩어리 (11)를 구별 할 수 없습니다.
기타 고려 사항은 다음과 같습니다 (예 : 귀금속 등) 특정 재료들을 쉽게 analy 할 수 있도록 할 수있는, 훨씬 더 높은 반사율과 별개의 스펙트럼 프로파일이ZE이 도구를 사용하여 스펙트럼지도. 같은 반 금속이 연구에서 조사 산화물과 탄소 기반 나노 물질 24, 27와 같은 다른 사람들은 그들의 원소 조성, 형상에 더 도전, 그리고 매트릭스에 따라 수 있습니다. 머서 의해 외. 두 뮤린 흡입 연구에서, 본 연구에 사용 된 것과 유사한 시스템이 폐와 주위 조직과의 현저하게 높은 콘트라스트 차에 기초하여 장기에 탄소 나노 튜브를 찾기 위해 사용 하였다. 탄소 섬유의 형상은 고유 식별을위한 충분한 특성이었다 때문에, 하이퍼 스펙트 럴 매핑은, 어느 연구 것으로 입증되지 않았다. 정상적인 생물 물리학 적 과정을 통하여 특정 장기에 관심 나노 입자를 증착하는 단계 (그리고 종종 그 자체 연구 주제) 예측할 수 있기 때문에, 적용 양성 대조군의 결정이 어려울 수 있으며, 상기 제어 m의 방법 생성을 고려를 요구한다 : 또 다른 고려 사항은 조직 특이 관한관심 물질의 상태에 영향을 ight. 스펙트럼 라이브러리는 관심 깨끗한 나노 입자에서 생성되는 경우, 예를 들어, 인한 변화에 따른 예를 들어 입자 (의 변화로 인한 스펙트럼 변화에 조직 또는 세포에서와 같은 나노 입자 라이브러리를 매핑하기 어려울 수있다 산도, 용해, 응집, 단백질 결합) 및 전체 미세 또는 매트릭스. 마지막으로,이 기술은 그 반 정량적 자연 제한된다 : 그것은 단지 쉽게 그러한 재료의 전체 장기 부담을 특징으로 작업을 수행 할 수 없음을 의미 유사한 해상도, 다른 이차원 현미경 기술로 정량 할 수있다.
전반적 EDFM 및 HSI는 TEM, HAADF 및 DIC 같은 종래 나노 이미징 특성화 기술에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. EDFM / HSI 더 집중적 편의에 비해 시간과 비용을 절약 빠른 이미지 획득 및 분석을 허용적인 기술. 또한 EDFM / HSI 용 샘플 준비 시간을 절약하고이어서 다른 기술에 사용될 수 있기 때문에, 또한 주어진 샘플의보다 유연한 분석을 허용하는 일반적으로 최소 및 비파괴 모두이다. 또한, HSI 많은 조성물의 나노 물질의 분석 및 행렬의 다양한 있도록 다재다능하다. 연구팀은이 기술의 특이성에 대한 심층적 인 평가를 포함한 기타 자료 및 샘플 유형, 여기에 기술 된 방법을 구체화하기 위해 노력하고 있습니다. 연구팀의 조사에서 중요한 다음 단계는 기존의 골드 표준에 대한 이러한 기술 검증 (예, 라만, TEM, SEM) 재료와 관심의 조직 유형.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
Materials
| CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
| Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
| Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
| CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
| cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
| cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
| type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
| 70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
| metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |
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