Bioluminescence imagerie d'un modèle animal pour immunocompétentes glioblastome

Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux et usage institutionnel à l'Université Northwestern et ont été réalisées dans des conditions stériles. 1. Modification de cellules GL261 avec luciole luciférase Exprimant NOTE: les vecteurs lentiviraux à base de VIH-1 expriment la luciférase de luciole (Fluc) sous le contrôle du promoteur du virus de la rate formant foyer (SFFV). Le gène rapporteur optique a été cloné dans le vecteur plasmidique pHRSIN-CSGW-dlNotI. Maintenir 293-T des cellules dans du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et des cellules de GL261 dans du milieu RPMI supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 95 % d'air et 5% de dioxyde de carbone (CO 2). Lorsque la culture de cellules 293-T atteint 80% de confluence dans un flacon T-75, laver les cellules une fois avec du phosphate solution saline tamponnée (PBS) sans Ca2 + et Mg2 +, incuber les cellules avec 3 ml de trypsine (0,05%) à 37 ° C pendant 5 min, trituré avec une pipette de 5 ml en maintenant le ballon légèrement incliné et collecter toutes les cellules du fond du flacon. Transférer le 3 ml de suspension de cellules traitées à la trypsine dans un tube conique de 15 ml et ajouter 7 ml de milieu RPMI chair (un total de 10 ml de la suspension cellulaire). Mélanger la suspension de cellules et avec une pipette 5 ml. Prendre 100 ul de la suspension cellulaire à partir du tube et compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. Pour ce faire, mélanger 100 pi de la suspension de cellules avec 300 ul de solution de bleu trypan et insérer 2 ul du mélange dans un hémocytomètre. Comptez le nombre de cellules sans coloration bleue de quatre points de vue différents sous un microscope. La moyenne du nombre de cellules de chaque vue, que ce nombre représente 10 4 cellules / ml. Pendant ce temps, centrifuger le tube contenant la suspension cellulaire à 300 g pendant 7 min. Aspirer les médias et remettre en suspension les culots de cellules avec du milieu RPMI frais pour faire une suspension de cellules de GL261 à une densité de 1,0 x 10 6 / ml. Seed 2,5 x 10 6 cellules GL261 avec 2,5 ml de milieu RPMI dans un flacon T-175 avec 27,5 ml de DMEM (jour 1). Après 24 heures, remplacer le milieu avec 20 ml de DMEM frais (jour 2). Pour produire le vecteur lentiviral, mélanger 54 ul réactif de transfection avec 2 ml DMEM dépourvu de sérum pendant 5 min. Ajouter 3 pg de gag-pol, 3 ug de virus de la stomatite vésiculaire G enveloppe (VSV-G), et 4,5 ug de Fluc (pSIN-Fluc) dans le DMEM avec un réactif de transfection, et incuber pendant 20 min à température ambiante. Déposer le mélange d'ADN dans toute la fiole T-293 (T-175) et incuber à 37 ° C dans une chambre humidifiée contenant 95% d'air et 5% de CO 2 pendant 48 heures (jour 2). Ajouter 10 ml de DMEM frais à 24 h après la transfection (volume total de milieu de culture cellulaire 293-T devrait être d'environ 30 ml) (jour 3). Pour diviser les cellules GL261 dans unPlaque de 24 puits, laver les cellules une fois avec PBS sans Ca2 + et Mg2 +, incuber les cellules avec 5 ml de trypsine (0,05%) à 37 ° C pendant 5 min, trituré avec une pipette de 5 ml en tenant le ballon légèrement incliné , recueillir toutes les cellules du fond du flacon, et compter les cellules via hémocytomètre comme dans l'étape 1.2. Pendant ce temps, centrifuger le tube à 300 g pendant 7 min. Aspirer les médias et remettre en suspension les culots de cellules avec du milieu RPMI frais pour faire une suspension de cellules de GL261 à une densité de 2,5 x 10 4 / ml. Seed 2,5 x 10 4 cellules GL261 avec 1 ml de milieu RPMI dans une plaque de 24 puits (jour 3). Recueillir 30 ml du surnageant avec 10 ml lentiviral pipette à partir de la fiole T-293 (T-175) à 48 h après la transfection et la transfère le surnageant dans 50 ml de tube conique. Aspirer le surnageant 30 ml d'lentiviral via une seringue de 50 ml, à travers un filtre à seringue de 0,22 um, et aliquoter le surnageant viral dans des aliquotes de 1 ml par jour (4). Remplacer les 1 ml de RPMI milieu dans la plaque de cellules GL261 (24 puits) avec 1 ml du surnageant lentiviral et incuber à 37 ° C dans une chambre humidifiée (jour 4). Après 48 h d'infection lentivirale, remplacer le milieu avec 1 ml de RPMI frais (jour 6). Après 24 heures, répéter l'infection lentiviral des cellules GL261 (jour 7). Après la 2 e 48 h d'infection lentivirale, remplacer le milieu avec 1 ml de RPMI frais (jour 9). Continuer à cultiver les cellules de luciférase GL261 modifié (qui sera désigné sous le nom de cellules GL261.luc) et développer la culture de cellules dans un flacon T-75. Lorsque la culture cellulaire GL261.luc atteint 70% de confluence dans un flacon T-75, récolter les cellules par trypsinisation et compter par hémocytomètre comme à l'étape 1.2. Plaque la cellule GL261.luc dans une plaque de 24 puits à des densités diplômés (1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, 2,5 x 10 4 cellules / puits) et incuber à 37 ° C dans un humidichambre fiée contenant 95% d'air et 5% de CO 2 pendant 3 heures. Mesurer cellulaire activité de la luciférase par rapport à la luciférase U-87 MG (U87.luc) des cellules à l'aide de l'imagerie par bioluminescence (figure 1) modifié. Démarrez le logiciel d'image (cliquez icône sur le bureau) et initialiser le système d'imagerie (cliquez sur le bouton "Initialiser"). L'initialisation démarre automatiquement et peut prendre plusieurs minutes pour le système check-up et la caméra refroidir à -90 ° C. Ajouter 25 pl de luciférine (D-Luciferin sel de potassium, 150 mg / kg) dans chaque puits. Incuber les cellules avec luciférine pendant 1 min à température ambiante et de l'image de la plaque pendant 10 sec. Pour configurer le système d'imagerie, sélectionnez "luminescent", "10 sec" temps d'exposition, et binning "Medium". Placer la plaque de 24 puits sur la station d'imagerie et cliquez sur le bouton "Acquérir" pour démarrer l'image. Après l'image est acquise avec succès, vous verrez une fenêtre d'image et un outil palette à l'écran. Cliquez sur "Roi (régions d'intérêt) Outils» et sélectionnez 6 x 4 à partir de l'icône de la fente. Créer 6 x 4 fentes pour couvrir la zone de signal sur l'image de la plaque de 24 puits et cliquez sur l'onglet mesures (crayon icône). Observez une fenêtre avec une table de mesures de ROI comme unité de photons par seconde par stéradian par centimètre carré (photons / s / sr / cm 2). Utilisation U87.luc cellules, préalablement à jour avec la même lentivirus utilisé ici pour la modification de GL261 11, en ​​tant que témoin pour l'évaluation de l'activité luciférase dans les cellules transduites GL261.luc. 2. Essai de prolifération in vitro Lorsque les cultures de cellules GL261 et GL261.luc atteignent 70% de confluence dans un flacon T-75, récolter les deux lignes de cellules par trypsinisation et comptées comme à l'étape 1.2, et de cellules de la plaque dans une plaque à 96 puits à une densité de 1500 cellules dans 80 ul de milieu RPMI par puits en utilisant une pipette multicanaux pour réduire le temps et l'erreur de pipetage. Seed chaque lignée cellulaire dans 20 puits au total. Pour limiter l'évaporation dans les puits peuplées par les cellules, remplissez puits vides avec 100 pi de milieu RPMI frais. Évaluer la prolifération cellulaire en utilisant un dosage de prolifération cellulaire colorimétrique. Ici, nous utilisons le dosage de prolifération de cellules MTS. En utilisant une pipette à canaux multiples, ajouter 20 ul de réactif MTS dans chaque puits de la plaque à 96 puits contenant des cellules. Incuber la plaque à 37 ° C dans une chambre humidifiée contenant 95% d'air et 5% de CO 2 pendant 3 heures. Mesurer l'absorbance à 490 nm en utilisant un lecteur de microplaques. Ceci est répété aux jours 1, 2, 4, et 7, après étalement. Pour normaliser les valeurs d'absorbance, les valeurs de chaque jour sont divisées par les valeurs correspondantes obtenues à jour une (Figure 2). 3. cellules tumorales Implantation Remarque: Autoclaver tous les équipements. Préparer zone chirurgicale par pulvérisation d'un désinfectant (solution de chlorhexidine à 2%) et couvrir avec absorbent rideaux. Afin de maintenir des conditions stériles, porter des gants chirurgicaux stériles pendant la chirurgie, et de diviser la zone chirurgicale en deux zones par un ruban de couleur. Zone 1 est étiqueté "Clean" et contient des fournitures stérilisées; Zone 2 est étiqueté "Dirty" et contient des matériaux utilisés. Avant la chirurgie d'animal, préparer une suspension de cellules pour l'injection intracrânienne. Cellules de récolte d'une confluence de 70% T-75 flacon par traitement à la trypsine et de compter les cellules via hémocytomètre comme dans l'étape 1.2, et faire une suspension de cellules à une densité de 1,0 x 10 5 cellules / ul dans une solution saline équilibrée de Hanks sans Ca 2+ et Mg2 + (HBSS). Anesthésier les souris avec une injection intraperitoneale de 200 ul de mélange contenant 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine dans une solution saline à 0,9%. Pour confirmer anesthésie appropriée, pincer le bout de la souris. Si la souris est complètement sous anesthésie, la souris ne devrait pas répondre au stimulus. Administrer 0,1 mg / kg de buprénorphine par injection sous-cutanée à soulager la douleur post-opératoire. Rasez le haut de la tête de l'animal à l'aide de tondeuses et propre avec un applicateur coton-tige trempé dans une solution de chlorhexidine à 2%. Appliquer une pommade oculaire à maintenir une lubrification adéquate pendant la chirurgie. Faire une incision sagittale environ 1 cm de long sur l'os pariéto-occipitale l'aide d'un scalpel stérile. Pour visualiser le bregma, essuyez la surface du crâne avec un applicateur coton-tige imbibé d'une solution de peroxyde d'hydrogène à 3%. Percer le crâne avec une aiguille 25 G stérile pour faire un petit trou de 3 mm à la droite de la bregma et juste derrière la suture coronale. Pour veiller à ce que intracrânienne site d'injection est à une profondeur de 3 mm du crâne, couper 3 mm hors de l'extrémité pointue d'une pointe de pipette 20 ul aide de ciseaux et d'insérer une seringue dans l'embout de pipette. Insérer la seringue perpendiculairement au trou précédemment créée, et injecter lentement le sus des cellules tumoralespension contenant 3,0 x 10 5 cellules dans 3 ul HBSS, sur une période de 1 min. Laissez l'aiguille en place pendant une minute, puis retirer lentement l'aiguille. Badigeonner le crâne avec le coton-tige trempé dans l'applicateur 3% de peroxyde d'hydrogène et la solution de chlorhexidine à 2%. Séchez la surface du crâne avec le coton-applicateur à bout. Découpez la cire osseuse stérile d'environ 3 mm 3 en taille et en fixer la cire d'os sur le côté de la fin de la coton-applicateur à bout. Appliquez la cire osseuse pour couvrir le trou avec le coton-applicateur à bout. Dessinez le chaque côté du cuir chevelu ainsi que sur le crâne à l'aide de pinces, et l'agrafer pour fermer la plaie. Nettoyer la plaie avec un coton-tige trempé dans une solution de chlorhexidine à 2%. Surveiller toutes les souris post-opératoire jusqu'à ce qu'ils deviennent ambulatoire et de conserver une activité normale. Typiquement, le temps de récupération est d'environ 30 min. Ne retournez pas les souris à la cage avec les autres animaux jusqu'à ce qu'ils aient complètement récupéré de l'anesthésie. <p class = "jove_title"> 4. Bioluminescence imagerie du GL261 croissance tumorale Vaporisez une quantité généreuse de désinfectant (solution de diméthyle de chlorure d'ammonium à 0,05%) sur une serviette en papier propre. Utilisez la serviette en papier imbibé de désinfectant pour essuyer soigneusement la feuille noire, cônes de nez et diviseur intérieur de la chambre d'imagerie où les animaux seront en contact avec l'appareil. Essuyez soigneusement toutes les surfaces avec une serviette en papier sec. Répétez cette fois de plus et attendre 5 min. Initialisation de la station d'imagerie comme dans l'étape 1.14.1. Anesthésier les souris avec un mélange de 300 ul contenant 200 ul de kétamine / xylazine et 100 pl de luciférine (D-luciférine, sel de potassium 150 mg / kg) par injection intraperitoneale. Attendre 10 minutes après l'injection et de confirmer si les souris sont complètement sous anesthésie en pinçant la queue. Pour configurer le système d'imagerie, sélectionnez "luminescent", "Auto" temps d'exposition, et binning "Medium". Placez les souris sur la stati d'imageriele et cliquez sur le bouton "Acquérir" pour démarrer l'image. Assurez-vous que le temps après l'injection est compatible avec chaque session d'imagerie. Après l'image est acquise avec succès, une fenêtre d'image et de la palette d'outils devraient apparaître. Cliquez sur "Outils de ROI" et sélectionnez "automatique" de l'icône de cercle. Pour définir ROI, encercler la zone de signal sur l'image, puis prendre des mesures de ROI comme unité de photons / s / SR / cm 2. Prendre les souris hors de la chambre de formation d'image et surveiller les souris jusqu'à ce qu'ils deviennent ambulant et conserver une activité normale. Typiquement temps de récupération est d'environ 15 min. Ne retournez pas les souris à la cage avec les autres animaux jusqu'à ce qu'ils aient complètement récupéré de l'anesthésie. Surveiller la croissance tumorale par imagerie par bioluminescence deux fois par semaine jusqu'à ce que les animaux présentent les symptômes suivants: perte de poids (perte de plus de 20% par rapport au poids avant l'implantation), inappétence (anorexie complète pendant 24 heures), et le manque de purposefu soutenuel réponse à des stimuli douce (de faible tentative de se lever), date à laquelle ils doivent être euthanasiés. Euthanasier animaux présentant ces symptômes en utilisant une chambre de CO 2 suivie d'une dislocation cervicale. La place souris dans la chambre de l'euthanasie (ne pas surpeuplé la chambre) et afflux compressés CO 2 pour 5-6 min. Observez que tous les animaux sont inconscience et ne respire pas après environ 5 min. Prenez les souris hors de la chambre. Assurez-vous que le cœur ne bat pas en sentant la poitrine entre votre pouce et l'index et vérifier qu'il n'y a pas de réflexe de clignement. Retenez la souris dans une position couchée sur une surface plane et de saisir l'arrière du cou à la base du crâne avec une main et base de la queue avec votre pouce et l'index de l'autre main. Retenez la tête et tirez rapidement la queue arrière. Assurez-vous que le crâne est séparée de la première vertèbre cervicale en utilisant votre pouce et l'index. Normealize valeurs de luminescence pour chaque jour contre les lectures correspondantes obtenues au premier jour de l'imagerie par bioluminescence comme à l'étape 2.3 (figure 3A). Pour l'analyse statistique, de générer des courbes de survie à l'aide de l'estimateur de Kaplan-Meier 12 et comparer les différences entre les courbes de survie en utilisant un test du log-rank 13.