神経膠芽腫のための免疫担当動物モデルの生物発光イメージング

以下で説明するすべての手順を見直し、ノースウェスタン大学の施設内動物の使用およびケア委員会によって承認され、滅菌条件下で実施されているされています。 ホタルルシフェラーゼを発現するレポーターでGL261細胞の1変更注：HIV-1ベースのレンチウイルスベクターは、脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ（Fluc細胞）を発現します。光学レポーター遺伝子は、ベクタープラスミドpHRSIN-CSGW-dlNotIにクローニングされています。 95を含有する加湿雰囲気中、37℃で、10％FBSおよび1％ペニシリン – ストレプトマイシンを補充したRPMI培地中で、10％ウシ胎児血清（FBS）およびGL261細胞を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で293-T細胞を維持します％の空気と5％の二酸化炭素（CO 2）。 293-T細胞培養物は、T-75フラスコ中で80％コンフルエントに達したときに、pHが一度細胞を洗浄Ca2 +およびMg2 +をなしosphate緩衝生理食塩水（PBS）、フラスコを保持することにより、5 mlのピペットで粉砕物がわずかに傾斜し、5分間37℃でトリプシン3mlの（0.05％）で細胞をインキュベートし、すべての細胞を回収フラスコの底から。 15 mlのコニカルチューブにトリプシン処理細胞懸濁液を3mlの転送、及び肉の7 mlのRPMI培地（細胞懸濁液を10mlの合計）を加えます。 5ミリリットルピペットでよく細胞懸濁液を混ぜます。チューブからの100μlの細胞懸濁液を取り、血球計数器を用いて細胞の数を数えます。これを行うには、トリパンブルー溶液300μlの細胞懸濁液100μlを混合し、血球計数器に混合物を2μlを挿入します。顕微鏡下で4つの別々のビューからブルー染色することなく、細胞数をカウントします。この数は、10 4細胞/ mlを表すように、各ビューからの細胞数を平均化します。 一方、30で細胞懸濁液の入ったチューブを遠心分離7分間0 XG。培地を吸引し、1.0×10 6 / mlの密度でGL261細胞懸濁液を作製するために、新鮮なRPMI培地で細胞ペレットを再懸濁します。 27.5ミリリットルのDMEM（1日目）とT-175フラスコにRPMI培地の2.5 mlの種子2.5×10 6 GL261細胞。 24時間後、20ミリリットル新鮮なDMEM（2日目）で培地を交換してください。 レンチウイルスベクターを製造するために、5分間の2ミリリットルの無血清DMEMで54μlのトランスフェクション試薬を混ぜます。トランスフェクション試薬を含むDMEMにギャグ-POLの3μgの、水疱性口内炎ウイルスGエンベロープ（VSV-G）の3μgの、およびFluc細胞の4.5μgの（PSIN-Fluc細胞）を追加し、室温で20分間インキュベートします。 293-Tフラスコ（T-175）に全体のDNAの混合物を落とし、48時間（2日目）、95％空気および5％CO 2を含む加湿チャンバー中、37℃でインキュベートします。 （3日目）（約30 mlであるべきである293-T細胞培養培地の全体積）トランスフェクション後24時間で新鮮なDMEMを10mlを加えます。 GL261細胞を分割するには24ウェルプレート、フラスコを保持することにより、5 mlのピペットで粉砕物がわずかに傾斜し、5分間37℃でトリプシン5mlの（0.05％）で細胞をインキュベートし、のCa2 +およびMg2 +を含まないPBSで細胞を1回洗浄、フラスコの底からすべての細胞を採取し、ステップ1.2のように血球計数器を介して細胞をカウントします。一方、7分間300×gでチューブを遠心します。培地を吸引し、2.5×10 4 / mlの密度でGL261細胞懸濁液を作製するために、新鮮なRPMI培地で細胞ペレットを再懸濁します。シード2.5×10 24ウェルプレート（3日目）でRPMI培地1mlの4 GL261細胞。 48時間後、トランスフェクションで293-Tフラスコ（T-175）から10 mlピペットでレンチウイルス上清の30ミリリットルを収集し、50mlコニカルチューブに上清を移します。吸引し、50mLの注射器を経由して30ミリリットルレンチウイルス上清、0.22μmのシリンジフィルターを通して、及び1mlアリコート（4日目）にウイルス上清を分取します。 Rの1ミリリットルを交換PMIのレンチウイルス上清1mlでGL261細胞プレート（24ウェル）中の培地と加湿チャンバー（4日目）に、37℃でインキュベートします。 レンチウイルス感染の48時間後、新鮮なRPMI（6日目）の1mlで培地を交換してください。 24時間後、GL261細胞（7日目）のレンチウイルス感染を繰り返します。 レンチウイルス感染の2 番目の 48時間後、新鮮なRPMI（9日目）1mlの培地を交換してください。 修飾されたルシフェラーゼGL261細胞を成長し続ける（GL261.lucセルと呼ぶことにする）と、T-75フラスコに細胞培養物を拡張します。 GL261.luc細胞培養物は、T-75フラスコ中で70％コンフルエントに達したとき、トリプシン処理により細胞を回収し、工程1.2と同様に血球計数器によりカウントします。卒業密度で24ウェルプレートにGL261.luc細胞をプレート（1.0×10 6 5.0×10 5、2.5×10 5、1.0×10 5、5.0×10 4、2.5×10 4細胞 /ウェル）、 humidiで37℃でインキュベート3時間、95％空気および5％CO 2を含む fiedがチャンバ。 細胞のルシフェラーゼ活性の相対測定は、生物発光イメージング（ 図1）を使用して、U-87 MG（U87.luc）細胞を改変ルシフェラーゼします。 （デスクトップ上のアイコンをクリック）画像ソフトウェアを起動し（「初期化」ボタンをクリックします）イメージング・システムを初期化します。初期化が自動的に開始され、システムチェックアップと-90℃に冷却するカメラのいくつかの分かかる場合があります。 各ウェルにルシフェリン25μlの（D-ルシフェリンカリウム塩、150mgの/キログラム）を追加します。 10秒間、プレートを室温で1分間、ルシフェリンと画像で細胞をインキュベートします。イメージング・システムを設定するには、「発光」、「10秒」の露光時間、および「中」ビニングを選択します。イメージングステーションの24ウェルプレートを配置し、画像を開始するには、「取得」ボタンをクリックします。 画像が正常に取得されたら、画像ウィンドウとツールPAが表示されます画面上レット。 「ROI（関心領域）ツール」をクリックして、スリットのアイコンから6×4を選択します。 24ウェルプレートの画像上の信号の領域をカバーし、測定タブ（鉛筆のアイコン）をクリックし、6×4のスリットを作成します。平方cm当たりステラジアンあたり毎秒光子（フォトン/秒/ SR / cm 2）での単位として、ROIの測定値のテーブルと窓を観察します。 以前GL261ためにここで使用したものと同じで修飾されたレンチウイルスの使用U87.luc細胞は、形質導入GL261.luc細胞におけるルシフェラーゼ活性を評価するための対照として、11を変形しました。 インビトロ増殖アッセイ2. GL261とGL261.luc細胞培養物は、T-75フラスコ中で70％コンフルエントに達したとき、トリプシン処理により細胞株の両方を収穫し、ステップ1.2のように数え、1500細胞の密度で96ウェルプレートにプレート細胞よく時間ピペッティング誤差を最小化するためにマルチチャンネルピペットを使用してあたりRPMI培地80μlの。セED 20ウェルの合計に各細胞株。細胞によって取り込まウェル中の蒸発を制限するために、新鮮なRPMI培地100μlの空のウェルを埋めます。 比色細胞増殖アッセイを使用して細胞増殖を評価します。ここでは、MTS細胞増殖アッセイを使用しています。マルチチャンネルピペットを使用して、細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルに20μlのMTS試薬を加えます。 3時間、95％空気および5％CO 2を含む加湿チャンバー中、37℃でプレートをインキュベートします。マイクロプレートリーダーを用いて490nmで吸光度を測定します。これはプレーティング後、1日目、2、4、および7で繰り返されます。吸光度値を正規化するために、毎日の値は、1日目（ 図2）で得られた対応する測定値で割ます。 3.腫瘍細胞移植注：すべての機器をオートクレーブ。消毒剤（2％クロルヘキシジン溶液）を噴霧することにより、手術領域を準備し、absorbenでカバートンのカーテン。 、無菌状態を維持する手術中に無菌手術用手袋を着用し、色のテープで2つの領域に手術領域を分割するために。エリア1は、「クリーン」と表示された、滅菌供給を含んでいます。エリア2は、「ダーティ」と表示されたと使用される材料が含まれています。 動物の手術の前に、頭蓋内注射用の細胞懸濁液を準備します。 70％コンフルエントのT-75フラスコをトリプシン処理することにより、ステップ1.2のように血球計数器を介して細胞をカウントし、Ca 2+をすることなく、ハンクス平衡塩溶液中に1.0×10 5細胞 /μLの濃度で細胞懸濁液を作り、から収穫細胞Mg 2+を（HBSS）。 0.9％生理食塩水でキシラジンのケタミンを100mg / kgおよび10mg / kgを含む200μlの混合物の腹腔内注射でマウスを麻酔。適切な麻酔を確認するために、マウスのつま先をつまみます。マウスが完全に麻酔下であれば、マウスが刺激に応答すべきでありません。 0.1メートルの管理皮下注射によりグラム/ kgのブプレノルフィンは、術後の痛みを緩和します。 バリカンを使用して、動物の頭の上を剃る、2％クロルヘキシジン溶液に浸漬綿チップアプリケーターで清掃してください。手術中に適切な潤滑を維持するために、眼軟膏を適用します。 滅菌メスを用いて、頭頂後頭部の骨の上に約1cmの長矢状切開を行います。ブレグマを視覚化するために、3％過酸化水素水に浸した綿チップアプリケーターで頭蓋骨の表面を拭きます。 ブレグマの右に、ちょうど冠状縫合の後ろに小さな穴3ミリメートルを作るために、無菌の25-G針で頭蓋骨をドリル。 頭蓋内注射部位は頭蓋骨から3mmの深さにあることを確実にするために、はさみを使用して、20μlのピペットチップの先端から3ミリメートルをカットし、ピペット先端に注射器を挿入します。 以前に作成した穴に垂直に注射器を挿入し、ゆっくりと腫瘍細胞のSUSを注入1分間かけて3μlのHBSS中3.0×10 5個の細胞を含む年金。別の分の場所にある針のままにして、ゆっくりと針を引き抜きます。 3％過酸化水素と2％クロルヘキシジン溶液に浸した綿先端アプリケーターで頭蓋骨を綿棒。綿チップアプリケーターで頭蓋骨の表面を乾燥させます。サイズは3約3ミリメートル無菌骨ワックスを切り出し、綿先端アプリケーターの端側の骨ろうを添付します。綿チップアプリケーターで穴をカバーするために、骨のワックスを適用します。 ピンセットを用いて頭蓋骨の上に一緒に頭皮の各側面を描き、ステープルは、創傷を閉鎖します。 2％クロルヘキシジン溶液に浸漬綿チップで傷をきれいにしてください。 彼らは歩行になるまで手術後、すべてのマウスを監視し、正常な活性を保持しています。典型的には、回復時間は約30分です。彼らは完全に麻酔から回復するまで、他の動物とのケージにマウスを返しません。 <p c小娘= "jove_title"> 4。 GL261腫瘍増殖の生物発光イメージング清潔なペーパータオル上の消毒剤の寛大な量（0.05％ジメチル塩化アンモニウム溶液）をスプレーしてください。徹底的に動物がデバイスと接触するイメージング室内の黒いシート、ノーズコーンと分周器を拭くために消毒剤に浸したペーパータオルを使用してください。徹底的にきれいな乾いたペーパータオルですべての表面を拭いてください。もう一度これを繰り返し、5分間待ってください。 ステップ1.14.1のように画像形成ステーションを初期化します。 腹腔内注射によって、ケタミン/キシラジン200μlのルシフェリン100μlの（D-ルシフェリンカリウム塩、150mgの/キログラム）を含む300μlの混合物を用いて、マウスを麻酔。 注射後10分待ってからマウスが尾をつまんで麻酔下で完全にされているかどうかを確認。イメージング・システムを設定するには、「発光」、「オート」、露光時間、および「中」ビニングを選択します。イメージングstatiにマウスを置きますで、画像を開始するには、「取得」ボタンをクリックします。注射後の時間は、各撮像セッションと一致していることを確認してください。 画像が正常に取得した後、画像ウィンドウとツールパレットが表示されます。 「ROIツール」をクリックして、サークルのアイコンから「自動」を選択します。関心領域を定義するには、画像上の信号の面積を取り囲む、その後SR光子/秒/ / cm 2の単位として、ROIの測定を行います。 画像化チャンバの外にマウスを取り、彼らは歩行になるまでマウスを監視し、正常な活性を保持しています。典型的には、回復時間は約15分です。彼らは完全に麻酔から回復するまで、他の動物とのケージにマウスを返しません。 体重減少（移植前の重量に対して20％以上の損失が相対的）、食欲不振（24時間のための完全な拒食症）、および持続的なpurposefuの欠如：動物は、以下の症状を提示するまで、週に二回生物発光イメージングによって腫瘍の成長を監視彼らは安楽死させるべき時に穏やかな刺激（最大得るために弱い試み）にL応答。頸椎脱臼に続いてCO 2チャンバーを用いて、これらの症状を有する動物を安楽死させます。 場所の安楽死室へのマウス（過密ないチャンバーを行う）と流入は5-6分間のCO 2を圧縮しました。すべての動物は、約5分後に呼吸無意識とではないことを確認します。 チャンバからマウスを取ります。心臓は親指と人差し指の間に胸を感じによって暴行されていないことを確認し、全く点滅反射がないことを確認してください。 平らな面に発生しやすい位置にマウスを拘束し、親指と他の手の人差し指と尾の片手と塩基と頭蓋骨の基部に首の後ろを把握します。 頭部を拘束し、素早く後方尾を引きます。頭蓋骨は、親指と人差し指を使用して第1頸椎から分離されていることを確認してください。 ノームステップ2.3（ 図3A）のように生物発光イメージングの最初の日で得られた対応する測定値に対する毎日のアリゼの発光値。 統計分析のために、カプラン-マイヤー推定量12を用いて、生存曲線を生成し、ログランク検定を使用して、13生存曲線間の差を比較します。