Tredimensionell Kvantifiering av Dendritutskotten från Pyramidal nervceller Härstammar från Human inducerade pluripotenta stamceller
Summary
Dendritutskotten av pyramidala nervceller är platserna för de flesta excitatoriska synapser i däggdjurs hjärnbarken. Denna metod beskriver en 3D kvantitativ analys av rygg morfologier i humana kortikala pyramidala glutamaterga neuroner som härrör från inducerade pluripotenta stamceller.
Abstract
Dendritutskotten är små utsprång som motsvarar de postsynaptiska fack excitatoriska synapser i det centrala nervsystemet. De är fördelade längs dendriter. Deras morfologi är till stor del beroende av neuronal aktivitet, och de är dynamiska. Dendritutskotten uttrycker glutamaterga receptorer (AMPA och NMDA-receptorer) på sin yta och med den grad av postsynaptiska tätheter. Varje ryggraden gör neuron att kontrollera dess tillstånd och lokal verksamhet självständigt. Spine morfologier har i stor omfattning studerats i glutamaterga pyramidala celler i hjärnbarken, använder både in vivo tillvägagångssätt och neuronala kulturer från gnagare vävnader. Neuropatologiska tillstånd kan vara associerade till förändrad ryggraden induktion och mognad, såsom visas i gnagare odlade neuroner och en-dimensionell kvantitativ analys 1. Den aktuella studien beskriver ett protokoll för 3D-kvantitativ analys av ryggraden morfologier användning av humant cortical neuroner härledda från neurala stamceller (sena kortikala stamceller). Dessa celler ursprungligen erhölls från inducerade pluripotenta stamceller. Detta protokoll möjliggör analys av ryggraden morfologier på olika odlingsperioder, och med eventuell jämförelse mellan inducerade pluripotenta stamceller som erhållits från kontrollindivider med de som erhållits från patienter med psykiatriska sjukdomar.
Introduction
Dendritutskotten av kortikala pyramidala nervceller är små och tunna utsprång som är fördelade längs basala och apikala dendriter av dessa neuronala subtyper hos gnagare, primater och mänskliga hjärnan. De är platserna för de flesta excitatoriska synapser och visa viktiga funktioner i lärande och kognitiva processer. De detaljerade strukturer mänskliga Dendritutskotten har tekniskt studerats genom elektronmikroskopi 2. Men är sådant tillvägagångssätt tidskrävande och representerar hög arbetsbelastning. På senare tid har en tredimensionell (3D) rekonstruktion av morfologi Dendritutskotten rapporterats i mänskliga hjärnan cortex använder särskild programvara kombineras till stora manuell rygg analys 3.
Fluorescerande protein (GFP) teknologi Grön kopplad till immunofluorescens utgör en korrekt verktyg för ryggraden identifiering och form mätning genom fluorescensmikroskopi. Detta tillvägagångssätt kan lätt appliceras på odlade neuroner. However, har inga uppgifter rapporterats på en analys av ryggraden mognad och morfologi om mänskliga nervceller härrör från inducerade pluripotenta stamceller (IPSC).
Syftet med denna studie var att beskriva ett protokoll, vilket gör att dendritiska ryggraden avbildning från odlade humana neuroner in vitro. GFP märkning, konfokalmikroskopi och 3D-analys med glödlamporna Tracer-modulen i Imaris programvara användes i detta protokoll. Kultur steg som är nödvändiga för att erhålla kortikala glutamaterga neuroner i skikt II-IV från neurala stamceller (NSC) är också beskrivs kortfattat här. Hela protokollet för human NSC produktion har redan publicerats på annat håll 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den kvantifiering av de morfologiska egenskaperna hos pyramidala nervceller förlitat sig på programvaran. Glöd Tracer gränssnitt användes för segmentering av nervceller och ryggar, och XT-modul användes för sin analys.
För att analysera riktigheten i vår teknik, vi först jämfört de uppmätta morfologiska parametrar (längd, area och total rygg volym i förekommande fall), med de som publicerats med hjälp av råtta mogna pyramidala nervceller i odling 6, 7 och mänskl…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.
Materials
| PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o vit A (50X) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Pen-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
Referenzen
- Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
- Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neurowissenschaften. 145, 464-469 (2007).
- Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
- Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
- Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
- Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
- Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
- Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
- Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).
