Вперед генетический подход к Раскройте стрессоустойчивости генов в мышах - высокой пропускной экране в ЭС клетках
Summary
Стрессоустойчивость является одним из признаков долголетия и, как известно, генетически регулируется. Здесь мы разработали метод объективную высокой пропускной для выявления мутаций, которые придают устойчивость к стрессам в ЭС клеток для разработки модели мыши для долголетия исследований.
Abstract
Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.
Introduction
Стаж имеет интимные отношения с стрессоустойчивости. В общем, долгоживущие виды часто демонстрируют повышенную устойчивость к нескольким стрессовых, таких как перекись водорода, паракват (PQ), УФ, тепла и тяжелых металлов 1,2. В противоположность этому, повышенная чувствительность к стрессу, как правило, предсказать сокращению срока службы и / или более фенотип болезни подверженных. Антиоксидант вывоз мусора путь уже давно предположили, играть важную роль в придании стрессоустойчивость животному. Тем не менее, с некоторыми исключениями, исследования из различных трансгенных животных с манипуляциями в различных антиокислительных ферментов (например, SOD) показывают, что увеличение уровня окислительных ферментов, поглощающих не увеличивает продолжительность жизни или здоровья продолжительность 3. Эти данные позволяют предположить, что стресс признак устойчивости последовательно наблюдается в долгоживущих животных посредничестве других клеточных путей еще не обнаружили.
Мы взяли объективную впередгенетический подход к идентификации генов, которые при, мутировал, может придать стрессоустойчивости фенотип в культуре эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. ЭС клетки предлагают два основных преимущества в этом исследовании: (1) сложные генетических манипуляций можно изменить геном ЭС клеток; и (2) любые устойчивые стресс ЭС клетки, выделенные из экрана могут быть непосредственно использованы для производства мыши, позволяя быстро перевод на целых исследований на животных для измерения продолжительности жизни и здоровья промежуток.
В этом докладе мы описали использование клеточной линии ES С9, в котором BLM аллелей под контролем с помощью тетрациклину элемента. Лечение доксициклина (DOX) временно отключен выражение Blm ведущую к увеличению инцидента сестра хроматид обмена. Эта краткосрочная BLM нокаут, разрешенных для производства гомозиготных мутаций в популяции гетерозиготного так, что рецессивные мутации для стрессоустойчивости может быть захвачен в процессе отбора. МыТакже описано применение PiggyBac (PB) транспозона мутагенеза случайно вставить поли-ловушка кассету (ПБ-УПА) мутировать генов в геноме. Клетки с нарушением гена, по поли-ловушка стал резистентные к G418, и могут быть восстановлены, так что совокупность генов ловушки мутантов (библиотеки генов-ловушка) может быть, а затем скрининг на мутант клонов, которые были устойчивы стресса.
Стресс резистентные клоны, выделенные из выбора можно охарактеризовать достаточно быстро с помощью молекулярных методов в отношении числа вставок (КПЦР), сайт инсерции (splinkerette ПЦР), идентичность нарушенного гена (BLAST), и его уровень экспрессии ( RT-КПЦР). Вставка РВ может быть remobilized по временной экспрессии MPB транспозазы в клоне, чтобы восстановить последовательность ДНК дикого типа и, таким образом проверить за потерю стрессоустойчивости. Эти мощные способы, чтобы подтвердить причинно-следственную связь мутации, которые должны быть сделаны додорогим производства мыши. Предыдущие исследования показали, что клетки подвергаются стресс-утратили плюрипотентности 4,5. Таким образом, в этом протоколе, сохранение набора реплик мутантных клеток, которые не будут обращаться с стресса является критическим для успешного производства мыши.
Наша лаборатория инженерии линии клеток C9 ES и вектор ПБ-УПА, и доступны для других исследователей по запросу. Протокол сообщил здесь начнется генерацией De Novo библиотеки генов-ловушке ЭС клеток с PB-УПА (рис 1А), с последующим реплик и выбор напряжения для изоляции стресс устойчивых клонов (Рис 1b). Мы показали, выделение параквату, мощного генератора свободных радикалов внутри клетки. Практически любая цитотоксического соединения или токсин, например, ER стресс-(например, тапсигаргин и туникамицина), нейронная окислителем (например, МРР +, 6-гидрокси допамина и ротенон), тепло, и тяжелаяметаллы (например, Cd, Se), могут быть адаптированы к способу для отбора соответствующих устойчивых мутантов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).
Materials
| Vector | ||
| PB-UPA | ||
| mPBase | ||
| mPBasePuro | ||
| Tissue Culture | ||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 |
| T25 Flask | Corning | 353108 |
| T75 flask | Corning | 353135 |
| 100-mm plate | Corning | 353003 |
| 150-mm plate | Corning | 430599 |
| 96-well plate | Corning | 3585 |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 |
| 24-well plate | Corning | 3526 |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | |
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 |
| Electroporation | ||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 |
| Molekularbiologie | ||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 |
| Electrophoresis | ||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S |
| 1Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L |
Referenzen
- Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
- Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
- Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
- Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
- Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
- Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
- Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
- Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
- Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310 (2014).
- Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
- Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
- Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
- Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20 (2004).
- Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).
