Approccio genetico in avanti per scoprire la resistenza allo stress geni nei topi - Uno Schermo high-throughput in cellule ES
Summary
Resistenza allo stress è uno dei tratti distintivi per la longevità ed è conosciuto per essere geneticamente governati. Qui, abbiamo sviluppato un metodo high-throughput imparziale per lo screening di mutazioni che conferiscono resistenza allo stress in cellule ES con cui sviluppare modelli murini per gli studi di longevità.
Abstract
Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.
Introduction
La longevità è un rapporto intimo con la resistenza allo stress. In generale, specie longeve spesso dimostrano una maggiore resistenza verso molteplici fattori di stress, come il perossido di idrogeno, il paraquat (PQ), UV, al calore, e metalli pesanti 1,2. Al contrario, l'aumento della sensibilità allo stress tende a prevedere vita ridotta e / o una maggiore fenotipo malattia soggetta. Il lavaggio via anti-ossidante è stato a lungo speculato a svolgere un ruolo importante nel conferire resistenza allo stress per l'animale. Tuttavia, con poche eccezioni, studi da una varietà di animali transgenici con manipolazioni in vari enzimi antiossidanti (ad esempio, SOD) indicano che l'aumento del livello di ossidanti enzimi scavenging non aumenta durata o durata di salute 3. Questi dati suggeriscono che la resistenza caratteristica sollecitazioni costantemente osservati in animali lunga durata è mediato da altre vie cellulari ancora essere scoperti.
Abbiamo preso un avanti imparzialeapproccio genetico per identificare i geni che su mutato, potrebbe conferire una resistenza allo stress fenotipo in staminali embrionali in coltura (ES) cellule. Cellule staminali offrono due grandi vantaggi in questo studio: (1) sofisticate manipolazioni genetiche sono a disposizione per modificare il genoma delle cellule ES; e (2) qualsiasi resistenti cellule ES di stress recuperate dallo schermo può essere utilizzato direttamente per la produzione di mouse, permettendo una rapida traduzione in studi su animali interi per misurare vita e durata della salute.
In questa relazione, abbiamo descritto l'uso della linea di cellule ES C9, in cui gli alleli BLM erano sotto controllo da un elemento sensibile alla tetraciclina. Trattamento di doxiciclina (DOX) transitoriamente spento l'espressione di Blm conseguente aumento incidente di scambio di cromatidi fratelli. Questo breve termine Blm knock-out permesso la generazione di mutazioni omozigoti all'interno della popolazione eterozigote in modo che le mutazioni recessive per la resistenza allo stress possono essere catturate nel processo di screening. Noianche descritto l'uso di piggyBac (PB) transposon come mutageno di inserire a caso un poli-Una cassetta trappola (PB-UPA) di mutare i geni nel genoma. Le cellule con rottura di un gene da parte del poli-Una trappola divennero G418 resistenti e potrebbero essere recuperati in modo che un insieme di mutanti del gene-trap (biblioteca gene-trap) potrebbe essere fatto, e, successivamente, proiettato per i cloni mutanti che erano resistenti stress.
Cloni resistenti stress recuperati dalla selezione potrebbero essere caratterizzati piuttosto rapidamente mediante tecniche molecolari in relazione al numero di inserimenti (qPCR), il sito di inserzione (splinkerette PCR), l'identità del gene interrotto (BLAST), e il suo livello di espressione ( RT-qPCR). L'inserimento PB potrebbe essere remobilized per espressione transiente di MPB transposase nel clone per ripristinare la sequenza di DNA wild-type e testare per la perdita di resistenza alle sollecitazioni in tal modo. Questi sono modi potenti per confermare la causalità della mutazione, che dovrebbe essere fatto primaalla produzione costoso mouse. Precedenti studi hanno dimostrato che le cellule esposte a fattori di stress hanno perso il loro 4,5 pluripotenza. Così, in questo protocollo, la conservazione di un set di repliche di cellule mutanti, che non sarebbe trattata con fattori di stress è un fattore critico per la produzione di successo del mouse.
Il nostro laboratorio ha realizzato la linea di cellule ES C9 e il vettore PB-UPA, entrambi sono a disposizione di altri ricercatori su richiesta. Il protocollo qui riportato inizierà dalla generazione di de novo biblioteca di cellule ES geni intrappolati con PB-UPA (Figura 1A), seguita dalla placcatura di replica e selezione sforzo per isolare cloni resistenti allo stress (Figura 1B). Abbiamo dimostrato la selezione con il paraquat, un generatore di radicali liberi potente all'interno delle cellule. Virtualmente, qualsiasi composto citotossico o tossina, per esempio, ER stress (ad esempio, tapsigargina e tunicamicina), ossidante neuronale (ad esempio, MPP +, dopamina 6-idrossi, e rotenone), calore, e pesantemetalli (ad esempio, Cd, Se), potrebbero essere adattati al metodo di selezionare per rispettivi mutanti resistenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).
Materials
| Vector | ||
| PB-UPA | ||
| mPBase | ||
| mPBasePuro | ||
| Tissue Culture | ||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 |
| T25 Flask | Corning | 353108 |
| T75 flask | Corning | 353135 |
| 100-mm plate | Corning | 353003 |
| 150-mm plate | Corning | 430599 |
| 96-well plate | Corning | 3585 |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 |
| 24-well plate | Corning | 3526 |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | |
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 |
| Electroporation | ||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 |
| Molekularbiologie | ||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 |
| Electrophoresis | ||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S |
| 1Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L |
Referenzen
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