Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.
Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.
Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions4. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry1,11,12.
While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,13 which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,14 which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles15 or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,18-20 these procedures will not be covered here.
We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. 21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,21,24 we will focus mainly on practical concerns.
Proceduren præsenteres her er en effektiv måde at fremstille mikroinjektion kanyler og microinjectors, der vil støtte i at belyse de molekylære substrater af motiveret adfærd. Denne metode har flere fordele. Først ved at fremstille egne implantater og microinjectors, nye eksperimentelle parametre kan hurtigt optimeres, dvs, man ikke behøver at vente på specialfremstillede komponenter at ankomme. For det andet, på grund af den lille diameter af kanylen, flere kanyler kan samtidig implanteret. Dette forkorter den nødvendige kirurgiske tid, som kan forbedre overlevelsesevne, og også tillader flere implantater pr dyr. For det tredje, den anvendte software til at styre de operantkamre let rumme progressive forholdet tidsplaner idet et fast forhold paradigme kan hurtigt omdannes til et progressivt forhold paradigme ved blot at anvende en begivenhed overgangen parameterliste, der indeholder den ønskede forstærkning tidsplan.
At værebredt anvendelig, blev en generisk mikroinjektion procedure præsenteret, der bør være bredt anvendelig til mikroinjektion af næsten enhver reagens i øjeblikket. Derfor forventer vi, at denne teknik fortsat vil være af tilsvarende høj nytteværdi i fremtiden med mindre modifikation. Ved kun at ændre nogle få variabler, kan denne fremgangsmåde anvendes til en lang række reagenser. Parametre, som hyppigst manipuleres omfatter længden at mikroinjektor rager ud fra kanylen, volumen injektion og på injektion. For eksempel kan man ønske injektoren at rage længere væk fra kanylespidsen for at undgå glial ar, der typisk danner omkring kroniske implantater. Derudover kan man ønske at indsprøjte en større volumen. For striatale virus mikroinjektioner, er et volumen på 1 pi typisk anvendes, og denne mængde indsprøjtes typisk over en længere periode (ofte 7 – 10 min plus 3 – 10 min yderligere diffusionstid) sammenlignet med denne brugd for farmakologiske reagenser (typisk 0,3 – 0,5 pi over 2 – 3 min plus 1 – 3 min ekstra diffusion tid). Brugeren bør konsultere litteraturen og / eller empirisk bestemme parametrene bedst passer til deres behov. Uanset, succesen af denne procedure er kritisk afhængig af 4 variabler: 1) kanyle længde, 2) mikroinjektor længde, 3) kvaliteten af mikroinjektor sprøjtemønster, og 4) systemets integritet før injektion. Fordi mikroinjektion placering er afhængig af den dybde, at mikroinjektor rager ud fra kanylen, er det bydende nødvendigt, at både kanyler (trin 1.2.8) og mikroinjektor længde (post-bøjning, trin 2.2.1) er begge nøjagtigt kendt og ensartet mellem alle emner . Dette kan let kontrolleres ved hjælp af let at afvise enhver gennemføre det er ikke den ønskede længde på det endelige re-måling. Desuden kan injektionen placering kun forudsiges, hvis den forekommer umiddelbart under ledekanylen. Således enhver mikroinjektor der does ikke sprøjte en lang, fin strøm efter test (Trin 2.4.6) bør afvises. En kvalitet injektion er også relateret til systemets integritet før injektion. Hvis der efter dispensering alt vand fra injektoren (før påfyldning af reagens) flere pletter observeres på professionel tørre, derefter en lækage skal afhjælpes (Bemærk på trin 2.4.8). Yderligere, hvis boblen (trin 2.4.9), der adskiller medikamentet fra vandet i PE20 slange er ikke en enkelt boble (efter fyldning af mikroinjektor med reagens), derefter injektoren er delvist tilstoppet. Denne træsko kunne enten forhindre eller aflede injektionen. Også dette kan let afhjælpes (Bemærk på trin 2.4.8).
Skulle man ønske at microinject mens dyret er i stereotaktisk ramme er der tre alternativer. For det første kan man forøge længden af mikroinjektor kraven, således at den kan holdes fast ved stereotaktisk manipulator og også strække sig langt nok til at tillade forbindelse til PE20 rør. For det andet, påe kunne timeligt implantere en kanyle og bruge standard mikroinjektor præsenteres her. For det tredje, man kunne bruge tegnet og poleret glas pipetter. 16,17
En væsentlig begrænsning af den procedure, der præsenteres her, er, at det er bedst udføres i godt håndteres rotter, der er fortrolig med proceduren. Rotter, der anvendes til de data, der er beskrevet i resultatafsnittet krævede ingen særlige håndteringsprocedurer fordi den samme investigator håndteres rotterne dagligt i over 2 måneder. Dette omfattede daglige observation og manipulation af kirurgiske implantat i mindst 2 uger. Dog kan rotter hurtigt vænnes af en række teknikker, der anvendes til før præ-puls inhiberingsassay, som kan blive påvirket af stress. Disse særlige tilvænnings- teknikker er blevet pænt detaljeret tidligere. 43 Ud over disse procedurer, er det tilrådeligt, at rotter skal vænnes til mikroinjektion procedure, hvor forkortede microinjectors benyttes during 'sham "injektioner. Under disse simuleret injektioner, er det afgørende, at mikroinjektor ikke rage ind i væv med henblik på at begrænse vævsskader. Med andre ord bør mikroinjektor bøjes ikke længere end 14 mm. Således kunne den grundige tilvænning er nødvendig for en optimal gennemførelse af denne teknik ses som en begrænsning.
Mens flere adfærdsmæssige paradigmer eksisterer for at måle motivation, er den progressive forholdet almindeligt anvendt til at kvantificere den indsats, at motivet er villig til at øve at få en forstærker. Den progressive forhold paradigme producerer en foranstaltning kendt som breakpoint, som ofte defineres som det maksimale antal ringpresser i det sidst afsluttede forhold;.. Dvs maksimal reagere der genererede en forstærker 21 Den progressive forhold er følsomt over for forstærkningsmiddel størrelsesorden. For eksempel højere kokain (eller saccharose) doser giver en højere breakpoint og nedre kokain (eller saccharose) doser gav en lavere breakpFælles. 21,22 Følgelig breakpoint er et rutinemæssigt anvendes proxy for motivation og / eller forstærkende effekt. 21,23-26 Da hensigten med breakpoint er at bestemme, når dyret ikke reagerer, en vigtig parameter for den progressive forholdet paradigme er sessionslængde. Finite session længder kan sætte en falsk loft over breakpoint værdier, og dette kan forværres af forbehandlinger som unormalt nedsætter hastigheden af selv-administration eller at stigningen efter forstærkning pause. Denne forvirre kan overvindes ved et vilkårligt antal tilgange.. F.eks sessioner, der ophører, når dyret har tilbageholdt reagerer nogle multiplum af den gennemsnitlige inter-infusion intervallet 44 En mere almindeligt anvendt variant af denne fremgangsmåde er at afslutte sessioner gang reagere har blevet tilbageholdt af nogle empirisk bestemt værdi, der holdes konstant på tværs af fag. Vi har givet den metode til at anvende denne fremgangsmåde i trin 4.4.9.11.
The authors have nothing to disclose.
MSB is supported by the Alcohol Beverage Medical Research Foundation, a Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), the National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537), and startup funds provided by the Virginia Higher Education Equipment Trust Fund and the VCU School of Medicine.
Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 gauge, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
#7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
Operant Chambers | Coulborun | Habitest |