JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

TRAP-rc, vertalen Ribosoom Affiniteitszuivering van Rare Cell Populaties van<em> Drosophila</em> Embryo

Published: September 10, 2015
doi:
10.3791/52985
, , , ,
1University of Clermont-Ferrand, 2Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

Abstract

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

Introduction

Begrijpen hoe cellen verwerven specifieke eigenschappen tijdens de ontwikkeling is cruciaal om de complexiteit van organen en hun mogelijke evolutie naar pathologische aandoeningen waarderen. Er is een groot onderzoek druk om het gen regulerende netwerken die cel specificatie en differentiatie ten grondslag liggen door unrevealing wereldwijde genexpressie profielen te ontcijferen, Pol II bindende status, transcriptie-factor bezetting op regulerende sequenties of post-translationele modificaties van histonen.

Om genexpressie te beoordelen op mondiaal niveau microarrays en RNA-seq benaderingen worden gebruikt. Microarrays laat mRNA overvloed te detecteren, terwijl RNA-seq is beter afgestemd op het informeren over de verschillende soorten van RNA's, waaronder codering en niet-coderende RNA's als microRNAs, lncRNAs of snRNAs. Toch kunnen deze technieken geen onderscheid actief-getranscribeerd, steady-state mRNA, actief-vertalen mRNA en mRNA invoeren van het afbraakproces. Meten steady-stat mRNA niveaus is bekend een slechte schatting van proteoom samenstelling 1-3 is. In tegendeel, het identificeren van een actieve-vertalen mRNA geeft een nauwkeuriger beeld van de eiwitproductie.

Echter, transcriptoom studies voornamelijk bij geheel organisme niveau uitgevoerd door het vergelijken van winst of verlies van functie van een bepaalde factor wildtype staat 4-7 of ontleed weefsel, waardoor genexpressieprofielen moeilijk te interpreteren. Recente ontwikkelingen in celgericht gereedschappen, affiniteitszuivering en verbeteringen gevoeligheid laat nu uitvoeren genoom-brede analyses op kleine celpopulaties of zelfs enkele cellen in een levend organisme.

In Drosophila, grote verzamelingen transgene lijnen mogelijk specifieke tijdelijke en ruimtelijke targeting van verschillende weefsels en celtypes via de GAL4 / UAS systeem 10/8 waardoor nauwkeuriger kwantificering van de moleculaire mechanismen die nodig is voor celfunctie.

<p class = "jove_content"> Onder de nieuw ontwikkelde benaderingen polysoom profilering door fractionering werd beschreven als een manier om vast te leggen actief-vertalen RNA 11. Deze methode gebaseerd op sucrosegradiënt centrifugeren maakt de selectie van polysoom fractie en de bepaling van mRNA vertaald genoombrede wanneer geanalyseerd met microarrays of deep sequencing. Polysoom isolatie kan worden gekoppeld met nuclease digestie ribosomale voetafdrukken overeenkomen met RNA fragmenten beschermd door de ribosomen in het vertaalproces 12 identificeren. Ribosomaal footprinting verhoogt de nauwkeurigheid van de kwantificering van RNA translatie en RNA-sequentie-niveau resolutie en ribosoom positionering maakt het mogelijk om te beoordelen van de vertaling te meten. Echter, tot op heden niet is toegepast celspecifieke isoleren van translatomes, voornamelijk als gevolg van de sterke daling van RNA verkregen opbrengst aan het einde van het ribosoom footprinting proces. Gezien het feit dat de grootte selectie van RNA potentiële vals-p kunnen genererenositives van verschillende RNP die ook kan worden beschermd RNA op soortgelijke wijze zijn verdere ontwikkelingen nodig ribosomale footprinting verbeteren en aanpassen aan celspecifieke benaderingen.

Een van deze methoden, de zogenaamde vertalen Ribosoom Affinity Purification (TRAP) is in 2008 beschreven door Heiman et al. en toegepast op de translatome isoleren van een subset van neuronen bij muizen. Door epitoop-tagging een ribosomaal eiwit in een celtype-specifieke wijze, kan polysomen selectief worden gezuiverd zonder bewerkelijke stap van cel dissociatie en sorteren. In dit geval is de 60S ribosomaal eiwit L10A aan het oppervlak van het ribosoom werd gelabeld met eGFP 13. Sinds 2008 hebben verschillende studies gebruikte deze methode in verschillende soorten, van muizen 14-19 tot en met X. laevis 20,21, zebravis 22,23 en Arabidopsis thaliana 24. De TRAP werkwijze is ook aangepast aan het Drosophila model en gebruikt om purify celtype-specifieke mRNAs van neuronale cellen en astrocyten 26 25. De veelzijdige binaire GAL4 / UAS werd gebruikt om GFP-gelabelde RpL10A in een weefsel-specifieke wijze tot expressie. Hoofden van volwassen vliegen werden ontleed om polysoom selectie van neuronale cellen (doelwit van pan-neurale Elav-Gal4 driver) en geïsoleerde RNA's uit te voeren werden gesequenced. Het grote aantal up-gereguleerde genen overeen met die bekende uitgedrukt in het zenuwstelsel, wat aangeeft dat de aanpak goede specificiteit en gevraagd ons aan te passen aan zeldzame celpopulaties (minder dan 1% van de cellen) die in ontwikkeling Drosophila embryo .

Binnen het Drosophila model, de embryonale fase is een model van keuze voor het onderzoek van ontwikkelingsprocessen, zoals de moleculaire spelers en morfogenetische mutaties evolutionair geconserveerd zijn. Het enige weefsel-specifieke transcriptomische aanpak tot nu toe uitgevoerd in dit model zijn uitgevoerd met behulp van cellen of nucleaire zorting en zijn alleen in staat om steady-state transcriptome 27-31 bestuderen geweest, het creëren van een behoefte aan methoden gewijd aan weefsel / cel-specifieke translatome profilering in de vlieg embryo. Hier rapporteren we de eerste TRAP-protocol gewijd aan Drosophila embryo's. Bij deze werkwijze werkzaam in mRNA-translatie in een zeer beperkte cel populatie van ongeveer 100 spiercellen per embryo werd succesvol geïsoleerd met hoge kwaliteit en specificiteit. De binaire GAL4 / UAS-systeem wordt gebruikt om de expressie van GFP-gelabeld RpL10A in subpopulatie van spieren rijden zonder enige toxiciteit, geen zichtbare fenotypen of ontwikkelingsvertraging zoals eerder aangegeven 25. Drosophila embryo bezitten 30 spieren per hemisegment die aanleiding geeft tot de musculatuur van de larve. Door een regulerend gebied ontdekt in de buurt van de slappe identiteit gen 6 van de 30 multi-kernhoudende spieren zijn gericht. In deze assay worden ribosomen geïmmobiliseerd op het mRNA met de translatie elongatieremmer cycloheximide. Cytosolische extracten worden gebruikt voor affiniteitszuivering met GFP antilichaam-beklede magnetische korrels. Kwaliteit van gezuiverde RNA werd gevalideerd met bioanalyzer. Kwantitatieve reverse transcriptie PCR (RT-qPCR) werd gebruikt om de specificiteit en sensitiviteit van mRNA isolatie te bepalen en toonde aan dat onze geoptimaliseerde protocol is zeer efficiënt.

Protocol

1. Fly Line Generation Genereren twee verschillende constructies. In het eerste construct wordt RpL10A cDNA (ribosomale subunit eiwit L10A) stroomafwaarts van GFP gekloneerd in pUASP-PL-GFP-nter plasmide (gewijzigde versie van 32). Het gebruik van een kiemlijn promotor maakt een polyvalent gebruik van de transgene lijn. LET OP: Haal de tweede construct door het klonen van de regulerende sequentie rijden weefsel-specifieke expressie van de slappe-gen stroomopwaarts van GAL4 (TF) met pPTGAL4 plasmide. Injecteren plasmiden afzonderlijk in w 1118 vliegt en steek constructies in de fly genoom door P-element inbrengen (volgens de standaard procedure) 33. Selecteer transformanten om te vliegen lijnen herstellen met constructies op twee verschillende chromosomen. De uiteindelijke TRAP lijn wordt gemaakt door deze twee lijnen (genetische kruisjes) te combineren met het oog op een dubbel-transgene stabiele lijn te krijgen. F0: W-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx W-; Cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: W-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massaal deze lijn te versterken en het verzamelen van de gewenste-geënsceneerd embryo's. 2. Embryo Collection Bereid 8 grote cilindrische bevolking kooien met ongeveer 40 g jonge vliegen per kooi (ongeveer 180.000 vliegen / kooi). Doorgaan met zogenaamde pre-liederen waarmee vliegt aan de ontwikkeling van embryo's te verwijderen uit de eileiders. Daarvoor lag de vliegen gedurende 1 uur op twee 11 cm diameter petrischalen die een mengsel van gestolde agar en druivensap en ⅓ bedekken van het oppervlak met verse gistpasta. Na 3 uitwisseling van druivensap platen verzamelen de echte embryo's over soortgelijke vers gemaakte platen. OPMERKING: incubatie tijd zal variëren afhankelijk van ontwikkelings-tijd-venster bestudeerd. Verwijder platen uit kooien en laat ze bij dezelfde temperatuur gedurende de tijd die nodig is om de juiste ontwikkelingsfase verkrijgen (bijvoorbeeld 3 h eileg + 10 h Additional incubatie geeft embryo's van het podium 10-13 uur na eileg (AEL)). Resuspendeer de plaat inhoud (embryo's, gist pasta, dode vliegen) met 50 ml water en een borstel. Ga door een reeks zeven (700 urn, 355 urn, 112 urn) embryo's uit dode vliegen en overige delen scheiden en verzamelen embryo op de zeef kleinere diameter vastgehouden, vervolgens kort spoelen in gedeïoniseerd water. Gebruik niet meer dan 18 platen per collectie als het de zeven kunnen verstoppen. Dechorionate embryo's in 4,5% bleekmiddel in gedemineraliseerd water gedurende 2 minuten en goed naspoelen met gedemineraliseerd water gedurende 30-60 sec. Incubeer embryo in PBS 0,01% Tween 20, 100 ug / ml cycloheximide, gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur onder schudden. Droge embryo's op cellulose absorberende lakens en overbrengen naar microcentrifugebuisjes. Weeg de buizen en flash-bevriezen de embryo's door onderdompeling in vloeibare stikstof. In dit stadium kan de gedroogde embryo's worden opgeslagen gedurende verscheidene maanden bij -80 ° C. <pclass = "jove_title"> 3. Voorbereiding van Magnetic Beads Gekoppeld aan GFP Antibody Grondig resuspendeer de Proteïne G magnetische korrels in de oorspronkelijke fles door voorzichtig schudden. Overdracht 90 ul van kralen aan een RNase-vrij buis en verzamelen ze op een magneet (30-60 sec). 90 ui bolletjes moet verrichten immunoprecipitatie (IP) met 1 ml lysaat bevattende 60-80 mg / ml eiwitten. Respecteer verhoudingen tot hiel verzadiging te voorkomen. Gebruik meerdere buizen volgens eiwit bedrag. Was kralen met 1 x PBS 0,01% Tween 20 (500 ui) en het verzamelen van parels op de magneet bovenstaande vloeistof. Voeg 30 ug GFP antilichaam in 350 ul PBS 0,01% Tween 20 aan de kralen en geïncubeerd onder langzaam over de kop mengen gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Verzamel kralen op de magneet (30-60 sec), gooi supernatant en spoel in 500 pl polysoomdisplays extractiebuffer (10 mM Hepes, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 1% Triton, Cycloheximide 100 ug / ml , Protease inhibitor 1 ×, RNase remmer 100 E). Verzamel kralen op de magneet en voeg 500 pl blokkerende buffer (BSA 0,1 ug / ul, gist tRNA 0,1 ug / ul, glycogeen 0,1 ug / ul in polysoomdisplays extractiebuffer). Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en een keer herhaal deze stap met verse blokkerende buffer. Verzamel kralen op de magneet en spoel in 500 ul polysoom extractiebuffer, dan herinneren kralen en direct doorgaan naar de immunozuivering stap (hoofdstuk 6). 4. Lysate Voorbereiding Voordat u begint, het opzetten van het programma op de multi-directionele hoge snelheid kralen molen: 2 × 10 sec bij 5000 toeren per minuut, 15 seconden pauze. Transfer gedroogde embryo's (1,5 g) tot 15 ml voorgekoeld buisjes op ijs met polysoomdisplays extractiebuffer en onmiddellijk gehomogeniseerd. Homogeniseer in 4 ml extractiebuffer polysoomdisplays 1,5 g embryo. Spread gehomogeniseerd embryo's in twee prechilled 2 ml buizen en maal de embryos door uitvoering van de homogenisator programma. Breng het lysaat in verse voorgekoelde microcentrifugebuizen op ijs en maak een Postnuclear supernatant door centrifugatie bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 2000 g. Breng supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis voorgekoelde op ijs, voeg 1/100 monstervolume van 10% Nonidet P-40 aan het supernatant (eindconcentratie = 0,1%) en meng voorzichtig door het buisje. Pulse-centrifuge het monster in een minicentrifuge om de vloeistof te verzamelen op de bodem van de buis, voeg 1/9 monstervolume van 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DHPC) (eindconcentratie = 30 mM ), meng het voorzichtig door het omkeren van de buis, en incubeer het mengsel op ijs gedurende 5 minuten (mix door meerdere malen om te keren tijdens de incubatie). Bereid de post-mitochondriaal supernatant door centrifugatie bij 4 ° C gedurende 10 min bij 20.000 g. Meet proteïneconcentratie door Bradford methode: concentratie lysaat moet tussen 60-80 mg / ml. Take de bovenstaande om een ​​frisse nieuwe voorgekoeld microcentrifugebuisje en onmiddellijk overgaan tot de pre-absorptie stap (hoofdstuk 5). 5. Pre-absorptie Grondig resuspendeer de magnetische korrels door voorzichtig schudden en breng 30 pl van parels in een microcentrifugebuis bij kamertemperatuur (30 ul kralen / 1 ml embryonale lysaat). Verzamel kralen op de magneet, pipet uit het supernatant en resuspendeer de kralen in polysoomdisplays extractiebuffer (500 ui). Verzamel kralen op de magneet, voeg embryonale lysaat en incubeer 1 uur bij 4 ° C op een rotator. Verwijder kralen en houden supernatant op ijs voor de immunozuivering stap. Voor immunozuivering houden 100 pl supernatant (input) mondiale RNA-monster te vergelijken met het RNA monster na immunozuivering verzameld door RT-qPCR bijvoorbeeld. 6. immunozuivering Voeg 1 ml (overeenkomend met 60-80 mg / ml eiwit) vanpre-geabsorbeerd lysaat aan een RNase-vrije buis met 90 pl van geblokkeerde parels gekoppeld aan GFP antilichaam. Incubeer de monsters bij 4 ° C gedurende 2 uur onder zacht end-over-end mengen in een buis rotator. Als alternatief, het uitvoeren van de incubatie O / N bij 4 ° C. Na incubatie verzamelen kralen op de magneet. Gebruik een minicentrifuge verminderde snelheid van de korrels vervolgens resuspenderen ze in 500 pl wasbuffer (Hepes 10 mM, KCl 350 mM, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mM, cycloheximide 100 ug / ml RNase inhibitor 100 U ) en verzamelen ze op de magneet. Herhaal deze stap nog twee keer. Verander de kralen aan een nieuwe voorgekoeld RNase vrije buis en was twee keer. Verzamel kralen op een magneet en ga verder met RNA-extractie door toevoeging van 1 ml TRIzol direct naar kralen en de instructies van de fabrikant. 7. RNA Clean-up en Quality Assessment Gebruik een RNeasy Micro Kit volgens de instructies van de fabrikant. Bij oplevering, elutkolome-RNA met een (x) pi RNase-vrij water. Warm gedurende 2 min bij 60 ° C en opslag snel bevroren monsters bij -80 ° C. Controleer RNA kwaliteit met bioanalyzer (volg de instructies van de fabrikant). Om de specificiteit van de Traped RNA te testen, uit te voeren reverse transcriptie op 3 ng gezuiverd RNA (input en IP) volgens de instructies van de fabrikant (superscript III). Met het cDNA verkregen qPCR gebruikt genspecifieke primer sets.

Representative Results

De Drosophila embryonale somatische spieren systeem bestaat uit 30 spieren per hemisegment, en elke spier heeft een specifieke set van eigenschappen: code van de identiteit van genen, positie, aantal fusie gebeurtenissen, aanhechtingsplaatsen en innervatie. Het identificeren mRNA vertaald in een bepaald spier deelverzameling wordt informatie over de eiwitten die nodig zijn om de specifieke spier kenmerken te vormen. De TRAP-gebaseerde methode, RNA uit een subpopulatie van spieren expressie identiteit gen traag werd gezuiverd (Figuur 1A-B). Een groot probleem van deze aanpak is de kwaliteit en specificiteit van het geïsoleerde RNA. De geoptimaliseerde protocol gemeld hier ingeschakeld systematische terugvordering van hoge kwaliteit RNA beoordeeld met bioanalyzer analyse. Het profiel verkregen shows geen afbraak van RNA (figuur 1C). In andere studies ontwikkeld rond de TRAP methode werden vragen gesteld over de specificiteit van de gegevens. Here i wemprove de methode om achtergrond in verband met niet-specifieke binding van RNA aan de korrels of de buizen en de optimalisering van de wasbuffer onderdrukken. Om het achtergrondniveau en efficiëntie isoleren-slappe expressie brengen beoordelen leidden we RT-qPCR proeven met 3 replicaten van hetzelfde embryonale fase. Fold-verrijkingen van 4 verschillende genen (MEF2, traag, prospero, soxNeuro) werden berekend ten opzichte van input en genormaliseerd tegen de RpL32 gen (figuur 1D). Deze resultaten toonden aan 2,3-voudige verrijking van pan-musculaire gen MEF2 en 5,6-voudige verrijking van de slappe gen. Daarentegen werden de twee genen tot expressie gebracht in het zenuwstelsel uitgeput vergelijking invoeren. Zeer vergelijkbaar voudige verandering waarden werden waargenomen op 3 biologische herhalingen, waaruit blijkt dat het protocol is robuust. Met Slouch-Gal4 chauffeur en beginnen met 1,5 g, rond 1.5×10 ^ 6 embryo's werden verkregen dat bevat 100 GFP cellen / embryo's (in totaal 150 x 10 ^ 6 positievecellen). Na het uitvoeren van de TRAP-experiment, de opbrengst is ongeveer 25-45 ng van specifieke RNA afhankelijk van de fase-of-interest. Dit materiaal is genoeg om microarray-analyse of RNA-seq met een amplificatie protocol om een ​​RNA-seq bibliotheek te bouwen draaien. Efficiëntie zal sterk afhangen van de sterkte van de bestuurder gebruikt RpL10A-EGFP tot expressie. Figuur 1. Kwaliteit en specificiteit evaluatie van TRAP geïsoleerd RNA uit Slouch-GAL4> UASRpL10A-EGFP embryo's. (AB) confocale beelden van een stage 16 embryo-tonen RpL10A EGFP-expressie specifiek in de zes Slouch spiercellen per hemisegment (A). Co-lokalisatie van RpL10A-EGFP met de algemene spier marker Beta3tubulin wordt waargenomen op merge foto (B). (C) Kwaliteitscontrole van Traped RNA ran op bioanalyzer toont perfecte integriteit van rRNA 18S en 28S. (D) RT-qPCR analyse tonen hoge specificiteit van TRAP geïsoleerd mRNA experimenten op 3 biologische herhalingen van fase-16 embryo's. Voudige verandering wordt berekend ten opzichte van input en genormaliseerd tegen de RpL32 gen. MEF2 transcripten aanwezig in alle spieren geslachten zijn 2,3-voudig verrijkt in vergelijking met ingang terwijl beperkter traag transcripten zijn 5,6-voudig verrijkt. Neurale cellen die Prospero en soxN genen zijn uitgeput 2,2-voudige en 5,5-voudige respectievelijk. Error bars vertegenwoordigt standaarddeviatie (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit document beschrijft een gemodificeerde vertalen Ribosoom Affinity Purification protocol (dubbed "TRAP-rc) gewijd aan de studie van zeldzame celpopulaties in Drosophila embryo. Informatie op de belangrijkste stappen voor een succesvolle isolatie van specifiek RNA in een opbrengst geschikt voor microarray en RNA-seq analyse, dat wil zeggen, 1) hoeveelheid van biologisch materiaal nodig is en geoptimaliseerd wijze van embryo lysis en extractie polysoomdisplays; 2) kralen / antilichaam-to-lysaat verhoudingen voor optimale immunoprecipitatie; 3) stappen waardoor vermindering van achtergrond met inbegrip van wassen buffer samenstelling om zo TRAP-rc experimenten met hoge specificiteit en gevoeligheid te voeren.

Dit protocol levert reproduceerbare gegevens waardoor het gemakkelijk toegepast op andere celtypen. Deze techniek maakt het mogelijk om differentiële genexpressie te analyseren op het niveau van actief-vertalen mRNA en aldus de weg vrijmaken voor het begrip van eiwitexpressie in plukje ific celsoort in een bepaald tijdskader. Merk echter op dat eiwit overvloed zal afhangen van de snelheid van de vertaling en afbraakprocessen. Een belangrijke beperking van de TRAP methode is het onvermogen om eiwitgehalte te meten op een nauwkeurige kwantitatieve wijze of post-translationele modificatie detecteren. Verbetering van de kwantificering door het meten van de dichtheid ribosoom aan het mRNA orgaan en daarmee in een celtype-specifieke wijze kan TRAP gecombineerd met ribosoom footprinting een zeer krachtig instrument maken. In een recent artikel 34, werd deze combinatie uitgevoerd in humane embryonale nier-293-cellen. De auteurs rende nuclease footprinting gevolgd door affiniteitszuivering van een induceerbare gebiotinyleerde vorm van RpL10A gebruik streptavidineparels. Dit is een bewijs van het principe dat het mogelijk is ribosoom footprinting voeren in een geheel organisme terwijl gericht op een specifiek celtype, de beperking waarbij de hoeveelheid biologisch materiaal welke hiertoe.

"> Performing TRAP experimenten parallel met de wereldwijde transcriptomische analyses zal het mogelijk maken om de verhoudingen tussen de nieuw-getranscribeerd en actively- vertalen RNA. Deze diep informatieve van de mogelijke post-transcriptionele mechanismen die plaatsvinden in specifieke ontwikkelingsstoornissen contexten of specifieke celpopulaties te volgen -door microRNAs bijvoorbeeld.

Concluderend TRAP is een zeer efficiënte, specifieke en gevoelige werkwijze voor het identificeren van RNA-gebonden actief vertalen van ribosomen in een cel-specifieke manier. Deze methode kan gebruikt worden in diverse organismen en weefseltypen. De nieuwe TRAP-rc hier beschreven protocol werd geoptimaliseerd voor zeldzame celpopulaties (minder dan 1% van het totaal aantal cellen) en een hoeveelheid eindmateriaal voldoende vervolgens geanalyseerd op hele genoom level.

Een mogelijke beperking van deze methode is de eis van een sterke bestuurder gelabelde ribosomen te produceren in voldoende hoeveelheid om compete met endogene niet-gecodeerde degenen in de beoogde celtype. In een recente studie 25, auteurs schatting 10-30% de verhouding van gemerkte versus untagged ribosomen.

Om dit probleem te verhogen van UAS-RpL10A-EGFP aantal kopieën moet aanzienlijk deze balans te verbeteren overwinnen. Alternatief, waardoor de beschreven genetische achtergrond een UAS-GAL4 transgen zal de productie van GAL4 eiwit te amplificeren en indirect verhogen expressie van RpL10A-EGFP. Dit moet een betere bezetting van gelabeld ribosomen op mRNA bevorderen.

Merk op dat deze reeds efficiënte benadering nog krachtiger door aanpassing complementaire methoden om een ​​kwantitatief aspect brengen of te ontdekken en te ontrafelen moleculaire mechanismen die essentieel zijn voor genexpressie zijn kunnen worden gemaakt.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

Materials

HEPES Sigma  H4034-1006
1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine  Avanti Polar Lipids 850306P
Glycogen thermo scientific  R0561
Purified BSA 100X  Biolabs B9001
Yeast tRNA  Sigma R5636
Super RNase In  Ambion AM2694
Antibody GFP clone N86/38 UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated 75-132 
Nonidet P40  Roche 11754595001
Precellys 24 Lysis homogenisation  Bertin Technology
Nuclease free water  Nalgene
Dynabeads ProteinG Invitrogen 10004D
Potassium chloride (KCl) Applied Biosystem  AM96406
Magnesium Chloride (MgCl2)  Applied Biosystem  AM95306
Cellulose waddin unbleached  VWR 115-2597 
Sieves 112, 355, 710 um  Retsch
TRiZol  Invitrogen 15596-018
MagRack 6 GE HealthCare  28948964
Low binding filter tips  ClearLine
Rnase free tube 1,5 mL  ClearLine 390689DD
Tween 20  Fischer Bioreagent  BP337-500
Cycloheximide  Sigma  C1985
Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free  Roche 11836170001
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).
  2. Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).
  3. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (1038).
  4. Junion, G., et al. Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors. Genes. 21, 3163-3180 (2007).
  5. Jakobsen, J. S., et al. Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network. Genes. 21, 2448-2460 (2007).
  6. Cunha, P. M., et al. Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity. PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).
  7. Sandmann, T., et al. A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster. Genes, & development. 21, 436-449 (2007).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512, 91-95 (2014).
  9. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).
  10. Gallo, S. M., et al. REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila. Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).
  11. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
  12. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).
  13. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  14. Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135, 749-762 (2008).
  15. Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells. Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).
  16. Fomchenko, E. I., et al. Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression. PloS one. 6, e20605 (2011).
  17. Helmy, K., et al. Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo. PloS one. 7, e46965 (2012).
  18. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  19. Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system. Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).
  20. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  21. Watson, F. L., et al. Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).
  22. Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).
  23. Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
  24. Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control. Molecular systems biology. 6, 419 (2010).
  25. Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PloS one. 7, e40276 (2012).
  26. Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles. G3. , (2015).
  27. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Res. 22, 766-777 (2012).
  28. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).
  29. Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity. Cell reports. 8, 858-870 (2014).
  30. Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis. Fly. 5, 261-265 (2011).
  31. Busser, B. W., et al. Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity. Development. 139, 1164-1174 (2012).
  32. Rorth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).
  33. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  34. Ingolia, N. T., et al. Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes. Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).

Tags

TRAPTranslating Ribosome Affinity PurificationRare Cell PopulationsDrosophila EmbryosMRNA TranslationCell-type-specificTranslatome AnalysisPolysomesTagged Ribosomal SubunitDevelopmental ProcessesDisease ProgressionCell-specific Gene ExpressionMicroarrayRNA-seqGal4/UAS SystemMuscle Cells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (103), e52985, doi:10.3791/52985 (2015).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image