희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em> 초파리</em> 배아

1. 플라이 라인 세대 두 개의 서로 다른 구조를 생성합니다. 첫 번째 구조에서, RpL10A의 cDNA (리보솜 단백질 서브 유닛 L10A)는 pUASP-PL-GFP – Nter 플라스미드에 GFP의 다운 스트림 복제됩니다 (32에서 수정 된 버전). 생식선 촉진제의 사용은 형질 전환 라인의 더 다가 사용을 허용한다. 참고 : pPTGAL4 플라스미드를 사용 GAL4 (TF)의 상류 능력있는 유전자의 조직 특이 적 발현을 구동 조절 서열을 복제하여 두 번째 구조를 얻습니다. 1118 파리 승에 별도로 플라스미드를 주입하고 33 (표준 절차에 따라) P-요소의 삽입에 의해 파리의 게놈에 구조를 삽입합니다. 순서대로 선택 형질 전환은 두 개의 서로 다른 염색체에 구조 플라이 라인을 복구 할 수 있습니다. 마지막 트랩 라인은 한 두 번 형질 전환 안정적인 라인을 얻기 위해이 두 라인 (유전 십자가)를 결합하여 생성됩니다. F0 : W-; CYO, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6BX W-; CYO / SCU; 슬러 GAL4 / TM6B. F1 : W-; CYO, UAS EGFP :: RpL10A; 능력있는 GAL4 / TM6B. 대규모이 줄을 증폭하고 원하는 스테이지 배아를 수집합니다. 2. 배아 컬렉션 케이지 당 젊은 파리의 약 40 g의 8 큰 원통형 인구 케이지를 준비 (180,000 파리 / 케이지 정도). 파리가 난관에서 개발 배아를 취소 할 수 있도록 소위 사전 낳는다 진행합니다. 이를 위해, 응고 한천 포도 주스의 혼합물을 포함하는 두 11cm 직경 페트리 접시에 1 시간 동안 파리를 놓고 갓 만든 효모 페이스트 표면의 ⅓을 커버합니다. 포도의 3 교환 후 주스 판은 유사한 갓 만든 접시에 실제 배아를 수집합니다. 참고 : 배양 시간은 연구 개발 시간 창에 따라 달라질 수 있습니다. 케이지에서 플레이트를 제거하고 되어온 (예, 알을 낳는 3 시간 + 10 시간 정확한 발달 단계를 얻기 위해 필요한 시간 동안 동일 온도에서이를두고하는 ional 배양은 10 ~ 13 시간 계란 부설 (AEL)) 후 단계에서 배아를 제공합니다. 브러시를 사용하여 물 50 ㎖와 함께 접시 콘텐츠 (배아, 효모 붙여 넣기, 죽은 파리를) 재현 탁. 죽은 파리에서 배아와 나머지 신체 부위를 분리하고 작은 직경의 체에 보유 배아를 수집 한 후 탈 이온수에 간단히 씻어 체 (700 μm의, 355 μm의 112 μm의)의 시리즈를 통해 이동합니다. 그것 자체를 방해 할 수있는 컬렉션 당 18 개 이상의 플레이트를 사용하지 마십시오. 탈 이온수에서 4.5 % 표백제에 Dechorionate 배아 2 분 동안 30 ~ 60 초 동안 탈 이온수로 철저히 씻어. 교반하면서 실온에서 5 ~ 10 분 동안, PBS 0.01 % 트윈 20, 100 μg의 / ㎖ 사이클로 헥시 미드의 배아를 품어. 셀룰로오스 흡수 시트에 건조 배아 및 마이크로 원심 튜브로 전송. 튜브를 달아 액체 질소에 침지하여 배아를 플래시 동결. 이 단계에서 건조 된 배아는 -80 ° C에서 수개월 동안 저장 될 수있다. <p클래스 = "jove_title"> 3. GFP 항체에 결합 자석 구슬의 준비 철저하게 부드러운 교반에 의해 원래의 병에 단백질 G에게 자기 구슬을 재현 탁. 전송 (90)의 RNase없는 튜브에 구슬의 μL 및 자석 (30 ~ 60 초)에 그들을 수집합니다. 비드의 90 μL 60-80 ㎎ / ㎖의 단백질을 함유하는 1 ml의 용 해물로 면역 침전 (IP)을 수행 할 필요가있다. 비드 포화를 방지하기 위해 비를 존중한다. 단백질의 양에 따라 여러 개의 튜브를 사용합니다. 자석에 씻어 1 × PBS 0.01 % 트윈 20 (500 μL)와 구슬과 수집 비즈 상층 액을 버린다합니다. 구슬에 PBS 0.01 % 트윈 20의 350 μL에 GFP 항체의 30 μg의를 추가하고 실온에서 30 분 동안 혼합 끝 이상 느린 끝으로 품어. 자석 (30 ~ 60 초)에 구슬을 수집 상층 액을 버리고 polysome 추출 버퍼 500 μL에 씻어 (헤 페스 10 밀리미터, KCl을 150 밀리미터,의 MgCl 2 5 밀리미터, DTT 0.5 mm의 트리톤 1 %, 사이클로 헥시 미드 100 ㎍ / ㎖의 홍보otease 1 × 억제제의 RNase 억제제 100 U). 자석 구슬을 수집하고 버퍼를 차단의 500 μL 추가 (BSA 0.1 μg의 / μL, 효모 tRNA는 0.1 μg의 / μL를 polysom​​e 추출 버퍼에서 0.1 μg의 / μL를 글리코겐). 실온에서 30 분 동안 품어 신선한 차단 버퍼에 한 번이 단계를 반복합니다. 다음 구슬을 회상하고 immunopurification 단계 (제 6 조)에 즉시 진행, 자석 구슬을 수집하고 polysom​​e 추출 버퍼 500 μL에 헹군다. 4. 해​​물 준비 시작하기 전에, 다 방향 빠른 속도 비즈 분쇄기에 프로그램을 설정 : 2 × 10 초 RPM 5000에서, 15 초 일시 정지를. 15 ㎖의 튜브에 전사 건조 배아 (1.5 g)을 polysom​​e 추출 완충액을 함유하는 얼음에 예냉, 즉시 균질화. polysom​​e 추출 완충액 4 mL에 1.5 g의 배아 균질화. 이 확산 균질화 배아는 2 mL의 튜브를 미리 냉각 및 엠브리 갈기균질 프로그램을 실행하여 OS. 얼음에 신선한 미리 냉각의 microcentrifuge 튜브에 해물을 전송하고 2,000g에서 10 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하여 postnuclear 상층 액을 준비합니다. 얼음에 신선한 미리 냉각 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송 상층 액 (최종 농도 = 0.1 %)로 10 % Nonidet P-40의 1/100 샘플 볼륨을 추가하고 튜브를 반전 가볍게 섞는다. 펄스 원심 minifuge의 샘플은 튜브의 바닥에서 액체를 수집하는 300 mM의 1,2- Diheptanoyl-SN 글리세로 -3- 포스 포 콜린 (DHPC) (최종 농도의 1/9 샘플 량 = 30 mm로 추가 )), 튜브를 반전시켜 부드럽게 혼합, 배양하는 동안 여러 번 반전 (5 분 동안 혼합 얼음 혼합물을 품어. 20,000g에서 10 분 동안 4 ℃에서 원심 분리 후 미토콘드리아 상층 액을 준비합니다. 브래드 포드 (Bradford) 방법에 의해 단백질 농도를 측정한다 : 파쇄물의 농도가 60 ~ 80 ㎎ / ㎖ 사이 여야한다. 티신선한 새로운 미리 냉각 microcentrifuge 관에 뜨는을 AKE 및 예비 흡수 단계 (5 장)에 바로 진행합니다. 5. 사전 흡수 철저하게 부드러운 교반 자석 구슬을 재현 탁하고 실온에서 microcentrifuge 관에 (비즈 / 1 ml의 배아 해물 30 μl를) 구슬의 30 μl를 전송합니다. 뜨는 오프, 자석에 피펫을 구슬을 수집하고 polysom​​e 추출 버퍼 (500 μL)에 구슬을 재현 탁. 자석에 구슬을 수집 배아 해물을 추가하고, 회 전자에 4 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. 구슬을 제거하고 immunopurification 단계 얼음에 뜨는을 유지. immunopurification 전에, 예를 들어 RT-qPCR에 의해 수집 된 후 immunopurification RNA 샘플과 글로벌 RNA 샘플을 비교하는 상등액 100 ㎕ (입력)을 유지한다. 6. Immunopurification 의 (60 ~ 80 ㎎ / ㎖ 단백질에 해당) 1 ML을 추가GFP 항체에 결합 차단 된 비드의 90 μl를 함유 된 RNase가없는 튜브로 파쇄물을 미리 흡수. 튜브 회전에서 부드러운 말을 통해 엔드 혼합 2 시간 동안 4 ° C에서 샘플을 품어. 또한, 4 ° C에서 배양 O / N을 수행합니다. 배양 후, 자석 구슬을 수집합니다. 0.5 mm의 사이클로 헥시 미드 100 μg의 / ㎖,의 RNase 억제제 (100) U 세척 버퍼 500 μL (헤 페스 10 mM이, KCl을 350 ㎜,의 MgCl 2 5mM의, Nonidet P-40 1 %, DTT에서 그들을 재현 탁, 구슬을 스핀 다운 minifuge를 사용하여 ) 및 자석에 그들을 수집합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 새로운 미리 냉각 된 RNase없는 관에 구슬을 변경하고 두 번 씻는다. 자석 구슬을 수집하고 구슬 트리 졸 직접 1 ml에 첨가하여 RNA 추출을 진행하고 제조업체의 지침을 따릅니다. 7. RNA 정리 및 품질 평가 제조업체의 지침에 따라하고, RNeasy 마이크로 키트를 사용합니다. 완료시, 엘 루트(X) μL의 RNase없는 물과 전자 RNA. 2 60 ° C에서 분 및 저장을위한 따뜻한 스냅 냉동 샘플을 -80 ° C에서. bioanalyzer를 사용하여 RNA의 품질을 확인 (제조업체의 지침에 따라). TRAPed RNA의 특이성을 테스트하려면, 제조업체의 지침 (첨자 III)에 따라 정제 RNA (입력 및 IP)의 3 NG에 역전사를 수행합니다. 유전자 특이 프라이머 세트를 사용하여 qPCR에 얻은 cDNA를 사용합니다.