Количественное Цитозольные против вакуолярной<em> Сальмонелла</em> В первичных макрофагах дифференциальной проницаемости

Внутриклеточные бактериальные патогены репликации либо непосредственно в цитозоль клетки-хозяина, или в специализированных вакуолярных отсеков ^1. Во время начальной стадии инфекции большинство патогенных микроорганизмов получают усвоены либо фагоцитоза специализированных клеток (например, макрофагов), либо активно продвигает свою собственную поглощение в не-фагоцитирующих клеток. В фагоцитирующих клеток, как правило, фагосомы сливается с лизосомы сформировать деструкции отсек, где фагоцитированы частицы переваренной. Специализированный цитозольные бактерии, такие как Francisella novicida или Shigella Флекснера, бежать деградации phagosomal, вызывая разрыв фагосомы и впоследствии бежать в цитозоле ^2,3. Это требует вирулентности-ассоциированных механизм таких как Francisella острова патогенности (FPI) или Shigella Флекснера T3SS, который впрыскивает эффекторные белки, которые способствуют вакуолярной разрыв ^2-4. Особенности клетка-хозяин цитозольныеКоличество сохраняемых распознающих рецепторов, которые обычно признают наличие возбудителей и вызывают иммунной сигнализации ^5. Кроме того, xenophagy, антимикробное форма аутофагии может ухудшить бактерии, которые попадают в цитозоль. Цитозольные бактерии, как правило, хорошо приспособлены к притупить или обойти эти ответы с помощью различных стратегий. Например, Francisella изменяет свои LPS, чтобы избежать признания хоста и шигеллы предотвращает набор аутофагии с помощью секретируемых белков эффекторные ^6,7.

Другая стратегия, чтобы избежать деградации лизосомами используется в модели вакуолярный возбудителя Salmonella enterica серовар Typhimurium, после называют Salmonella Typhimurium. Сальмонелла использует T3SS чтобы придать эффекторы, что переделывать первоначальный фагосомы в его внутриклеточной ниши, сальмонеллы -содержащего вакуоли (ПЗК) ^8,9. Непрерывная манипуляции принимающих путей являетсянеобходимо сохранить эту вакуоль по вербовке липидов и других питательных веществ в вакуоли. Действительно, SIFA мутант Salmonella не удается поддерживать стабильность вакуолярной, и входит в цитозоле клеток-хозяев в течение нескольких часов после заражения, что приводит к активации врожденного иммунитета путей и аутофагии набора ^8. Вакуолярной побег Salmonella варьируется в зависимости от типа клеток, что является исследования, и несколько отчетов показали, что в эпителиальных клетках даже БТ Сальмонелла может избежать SCV и hyperreplicate в цитозоле ^10. Последние отчеты показывают, что врожденная иммунная обнаружения патогенов вакуолярных также зависит от способности хозяина, чтобы признать и дестабилизировать патогенов, содержащий вакуоли (PCVs) ^11-14.

Учитывая, что оба хоста или бактерии генотип может влиять на распределение внутриклеточных бактерий между вакуолярную и цитозольной отсека, необходимо определить число вакуоли VS.цитозольные бактерии. Так, в большинстве экспериментальных установок клетки-хозяева инфицированы более чем одной бактерии, и в дальнейшем может питать несколько бактерий в различных субклеточных отсеков, метод необходим, что позволяет количественной на уровне отдельных бактерий. Дифференциальный пермеабилизации (также известный как защита phagosomal анализа) обеспечивает эту резолюцию ^2,4,10,12. Анализ основан на селективной проницаемости мембраны клетки-хозяина плазмы с моющим средством дигитонин, что оставляет нетронутыми вакуоли мембраны и, таким образом, позволяет избирательно окрашивание цитоплазмы бактерии с антителами. Здесь мы предлагаем два протокола для количественного определения цитозольного и вакуолярной Salmonella Typhimurium, используя дифференциальный пермеабилизации. Принцип этого метода описан в рисунке 1: костный мозг, полученные макрофаги (BMDMs) заражены стационарной фазы mCherry-выражения сальмонеллы. Стационарная фаза сальмонеллы нужно тО быть использованы, потому что они подавляют экспрессию SPI-1 T3SS, чья деятельность в противном случае будут признаны инфламмасома NLRC4 и вызывают быструю смерть клеток (pyroptosis) в BMDMs ^15. После инфекции клетки промывают и обрабатывают 50 мкг / мл дигитонина в течение 1 минуты. Клетки снова промывают сразу и инкубировали с анти-антител сальмонеллы, соединенных с FITC, чтобы отметить бактерии с доступом в цитозоль. После дополнительного этапа промывки клетки лизируют и процент mCherry + (вакуоли) и FITC + / + mCherry (цитозольного) бактерий определяется FACS. Мы также сообщают об адаптации этого метода, которые могут быть использованы, если нет флуоресцентные штаммы, экспрессирующие белок не доступны (рисунок 2). Дополнительные шаги вводятся после FITC маркировки, в котором клетки фиксированной и полностью проницаемыми. После этого все бактерии окрашивали анти Salmonella антител и соответствующих вторичных антител. Detотражения затем сделать с помощью микроскопии вместо анализа FACS.