The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.
zebrafish विकास जीव विज्ञान और रोग के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान आनुवंशिक मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। Zebrafish मानव सहित अन्य रीढ़ के साथ, सेलुलर आणविक, और शारीरिक प्रक्रियाओं में एक उच्च जीनोमिक संरक्षण की डिग्री है, साथ ही समानता का हिस्सा है। जल्दी व्यक्तिवृत्त के दौरान, zebrafish भ्रूण शोधकर्ताओं ने एक साधारण stereomicroscope का उपयोग जीवोत्पत्ति की गतिशीलता कल्पना करने के लिए अनुमति देता है, ऑप्टिकली पारदर्शी होते हैं। Microbead आरोपण स्थानीय वातावरण में कारकों में परिवर्तन के माध्यम से ऊतक हेरफेर सक्षम बनाता है एक विधि है। यह शोधकर्ताओं जैसे विकासशील भ्रूण के भीतर विशिष्ट स्थानिक और लौकिक बिंदुओं पर स्रावित पेप्टाइड्स, के रूप में ब्याज की संकेतन अणुओं के किसी भी संख्या के प्रभाव को परख करने के लिए अनुमति देता है। यहाँ, हम विस्तार से जल्दी zebrafish विकास के दौरान हेरफेर और प्रत्यारोपण मोतियों के लिए कैसे के लिए एक प्रोटोकॉल।
विकासात्मक जीव विज्ञान शोधकर्ताओं ने एक जीव का गठन कैसे किया जाता है कि नियंत्रण तंत्र को उजागर करने के लिए, सेलुलर आणविक, और आनुवंशिक तरीकों की एक विशाल सरणी का उपयोग। इन तरीकों के अलावा, ऊतक हेरफेर सेल भाग्य, सेलुलर आंदोलन, और ऊतकों के संगठन के बारे में जटिल सवालों का गूढ़ रहस्य में एक महत्वपूर्ण उपकरण है। स्थानीय ऊतक वातावरण को बदलने के लिए एक तरह से प्रोटीन या अन्य संकेतन अणुओं 1 का केन्द्र स्रोत वितरित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि microbeads की शल्य आवेदन के माध्यम से है। प्रयोगात्मक हेरफेर के इस प्रकार के व्यापक रूप से इस तरह के मेंढक और लड़की के रूप में 2 शास्त्रीय कशेरुकी भ्रूण विज्ञान मॉडल, में लागू किया गया है।
zebrafish जीवोत्पत्ति के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण कशेरुकी मॉडल जीव बन गए हैं और वे मनुष्यों 6 के साथ उच्च आनुवंशिक संरक्षण साझा के रूप में भी रोग मॉडलिंग 3-5 के लिए कई अद्वितीय लाभ प्रदान किया है। विशेष रूप से, ऑप्टिकल पारदर्शिता और पूर्व मेंzebrafish भ्रूण की तेहरा विकास ऊतक व्यक्तिवृत्त 3-5 के अवलोकन के लिए एक बेजोड़ दृष्टिकोण प्रदान करता है। बड़े पैमाने पर आगे आनुवंशिक स्क्रीन के कार्यान्वयन के आगे के अध्ययन के 7,8, और कुशलता से एकल प्रयोगशालाओं 9,10 में कम पैमाने पर आयोजित किया जा सकता है कि वैकल्पिक स्क्रीनिंग तकनीक की पहचान के लिए zebrafish उत्परिवर्ती उपभेदों के एक शक्तिशाली रिपोजिटरी उत्पन्न किया है। इसके अलावा zebrafish साथ प्रयोगात्मक कार्य ट्रांसजेनिक के तरीके में प्रगति के माध्यम से मदद की और आनुवंशिक दृष्टिकोण 11,12, साथ ही रासायनिक आनुवंशिकी 13-15 रिवर्स कर दिया गया है।
ऐसे microbeads के कार्यान्वयन के रूप में ऊतक हेरफेर तकनीक, व्यापक रूप से zebrafish में कार्यरत रूप में किया गया है, लेकिन फिर भी आगे के विकास के दौरान कोशिका संकेतन को समझने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान नहीं की है। Microbead आरोपण zebrafish रेटिना में अंग गठन की प्रक्रिया से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया गया है16,17, दिल 18, मस्तिष्क 19-22, तंत्रिका शिखा 23, और 24,25 फिन। इन और अन्य अध्ययनों में, मोती ढ़ाल सेल प्रवास 27 और अक्षीय patterning के 28 कैसे प्रभावित संकेतन अणुओं 26 के प्रसार को समझने के लिए विकास के दौरान लागू किया गया है। हाल ही में, microbeads के लिए zebrafish वयस्कों के 29 में उत्थान तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया गया है। विकास अध्ययन में, उदाहरण के लिए, zebrafish microbead काम छाती पर का कवच पंख 25 के अध्ययन के माध्यम से अंग गठन के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। zebrafish छाती पर का कवच पंख कली माउस 30 और लड़की 31 में forelimb कली को मुताबिक़ है। कशेरुकी अंग कली दो आवश्यक संकेतन नोड्स है: ध्रुवीकरण गतिविधि ध्वनि हाथी की अभिव्यक्ति के माध्यम से पूर्वकाल-टू-पीछे अक्ष स्थापित करता है कि (ZPA) (श) और नीचे की ओर Hox जीन लक्ष्य का क्षेत्र,और fibroblast वृद्धि कारकों की अभिव्यक्ति (Fgfs) के माध्यम से अंग के बाहर का पहचान करने के लिए समीपस्थ स्थापित करने के लिए कार्य करता है जो अंग कली, की नोक पर मौजूद शिखर बहिर्जनस्तरीय रिज (AER)। zebrafish श्श्श आनुवंशिक म्यूटेंट, जांचकर्ताओं में FGF लथपथ microbeads दाखिल कशेरुकी अंग 25 की कोशिका चक्र और विकास की प्रगति के लिए आवश्यक के रूप में FGF की पहचान की। इसके अलावा स्थितीय पहचान स्थापित कि FGF और श्श्श संकेत Cascades, पहचान 32 पीछे पूर्वकाल स्थापित करने के ध्रुवीकरण क्षेत्र की कार्रवाई की नकल कर सकता है कि एक अणु के रूप में retinoic एसिड (आरए) की पहचान की लड़की के अंग कली का उपयोग करते हुए अग्रणी अध्ययन। लड़की अंग में आरए से लथपथ वाटमान कागज के छोटे स्ट्रिप्स रखकर शामिल इन प्रयोगों अंकों patterning के 32 मूल्यांकन करने के लिए। इसके अलावा, शोधकर्ताओं microbeads के उपयोग को रोजगार अन्य सुरुचिपूर्ण पढ़ाई प्रदर्शन किया है, कोशिका प्रत्यारोपण, और exogenousZebrafish में आरए उपचार आरए zebrafish पश्चमस्तिष्क और mesoderm 28 के भीतर लंबी दूरी स्थितीय संकेतों प्रदान करने के लिए कार्य करता है कि निर्धारित करने के लिए। हालांकि, वर्तमान में कई सवाल कशेरुकी विकास के कई पहलुओं के दौरान FGF और रा जैसे कारकों संकेत की भूमिका के बारे में रहते हैं। आरए के संकेत प्रभाव, एक morphogen के रूप में अभिनय, इस तरह के आरए समीपस्थ गुर्दे की कोशिकाओं भाग्य 35-39 प्रकार निर्दिष्ट जहां विकासशील दिल 34 और गुर्दे पूर्वज के रूप में कई अंगों 33, प्रभाव। इस तरह के विषयों के आगे समझने ऊतक हेरफेर और microbead आरोपण तकनीक का उपयोग कर प्रयोगात्मक अध्ययन से काफी फायदा हो सकता है।
लड़की की तरह मॉडल की तुलना में जब कम पढ़ाई के लिए zebrafish में microbead आरोपण के साथ प्रदर्शन किया गया है, वहीं बाहर किया गया है कि उन बेहद जानकारीपूर्ण किया गया है। Zebrafish भ्रूण में microbead आरोपण आधारित अनुसंधान की कमी का एक कारण likel हैY एक बाधा सफलतापूर्वक ऐसे जोड़तोड़ करने के लिए प्रदर्शन का गठन जो भ्रूण के आकार के आधार पर, कठिन तकनीकी चुनौतियों का सामना कर रहे हैं कि यह विचार। हालांकि, zebrafish भ्रूण में microbead आरोपण अभ्यास के साथ सीखा और तकनीक के दृश्य अवलोकन के माध्यम से सहायता प्रदान की, और इस तरह के विकास के तंत्र से पूछताछ करने के लिए एक साधन के रूप में चलाया जा सकता है किया जा सकता है। यहाँ, हम ऊतक गठन और सेलुलर morphogenesis पर assays के एक विस्तृत विविधता के संचालन के लिए उपयोग किया जा सकता है, जो zebrafish भ्रूण में एक microbead की सटीक आवेदन प्रदर्शित करता है।
पिछली सदी में, शरीर योजना patterning और जीवोत्पत्ति की समझ स्मारकीय अग्रिमों आया है। ऊतक हेरफेर तकनीक इन महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी को उजागर करने में महत्वपूर्ण थे। आनुवंशिक संशोधन जीन समारोह सुनिश्चित करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है, और इस तरह के सेल प्रत्यारोपण के रूप में मोज़ेक विश्लेषण के तरीकों, जीन समारोह की स्वायत्तता को समझने के लिए उपयोगी दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। Microbead आरोपण इस विधि संकेतन अणुओं या अवरोधकों को शुरू करने से एक स्थानीय ऊतक वातावरण में परिवर्तन करने के शोधकर्ता सक्षम बनाता है, के रूप में विकास की गतिशीलता को बदल कैसे विशेष अणुओं से पूछताछ करने के लिए एक और स्थल प्रदान करता है। अलग microbeads की एक श्रृंखला की अलग आकार और अन्य भौतिक गुणों वे ब्याज की प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए नियोजित किया जा सकता है कि इस तरह के (जैसे, प्रभार) मौजूद है कि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इस प्रकार, एक प्रोटीन या chemi में भिगो कर रहे हैं कि microbeads के द्वारा दाखिलएक जीव के भीतर ब्याज की कैलोरी, शोधकर्ताओं ने विकास के दौरान स्थानीय प्रभाव की जांच और जीन या ब्याज और विशेष रूप से जैविक फेनोटाइप (एस) के अणु के बीच संघों पा सकते हैं।
ऐसे zebrafish 23 में पूर्वकाल neurocranium (एएनसी) में कंकाल आकृति में वृद्धि हुई हाथी संकेतन के प्रभाव का आकलन करने के क्रम में microbead आरोपण इस्तेमाल किया वाडा द्वारा प्रदर्शन एक और सहयोगियों के रूप में अध्ययन। पिछले अध्ययनों श्श्श एएनसी गठन 14 के लिए आवश्यक है कि पता चला है। का प्रयोग श्श्श में लिपटे microbeads के शोधकर्ताओं ने यह संकेत एएनसी में उपास्थि गठन को बढ़ावा देता है कि पहचान की। microbead आरोपण प्रक्रिया एएनसी में हाथी संकेतन और उपास्थि के गठन के बीच एक स्पष्ट कड़ी प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। वैज्ञानिकों Erythroblastoma छब्बीस की ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण की जांच की जहां zebrafish में इस ऊतक हेरफेर तकनीक का एक अन्य प्रमुख उदाहरण के अध्ययन में मनाया जाता है (टिकट) डोमेन चअभिनेताओं के टिकट से संबंधित अणु (एर्म) और जल्दी zebrafish मस्तिष्क के विकास के दौरान 19 FGF संकेतन द्वारा Polyoma बढ़ाने उत्प्रेरक 3 (Pea3)। Microbead आरोपण प्रयोगों के माध्यम से, वे Fgf8 और Fgf3 ectopically एर्म और pea3 की अभिव्यक्ति को सक्रिय कर सकते हैं दिखाने के लिए सक्षम थे। ये उदाहरण जीन अभिव्यक्ति 41 का आकलन करने के तरीकों के उपयोग से अच्छी तरह से विशेषता जा सकता है जो ऊतक गठन के दौरान सहयोग कि विकास तंत्र, में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए microbeads की उपयोगिता को दर्शाते हैं। इस प्रकार, microbead प्रत्यारोपण जैसे गुर्दे को जन्म देता है जो मध्यवर्ती मेसोडर्म (आईएम) के रूप में अन्य ऊतकों, पता लगाने के लिए एक व्यावहारिक तरीका हो सकता है। विशेष रूप से, यह नेफ्रॉन 42 विभाजन और 43,44, केवल अल्पज्ञता वर्तमान में समझ रहे हैं कि प्रक्रियाओं tubulogenesis को प्रभावित कैसे अलग अणुओं की जांच करने के लिए, गुर्दे विकासात्मक अध्ययन में सहायता करेगा। इसके अलावा, microbead आरोपण संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए शुरू हो गया हैzebrafish 29] और y के उत्थान प्रक्रियाओं ऐसी इसी वयस्क संरचनाओं के साथ अनुसंधान प्रदर्शन करने के लिए तैयार किया गया है कि तरीकों के साथ नेफ्रॉन 45 या संयोजन के रूप में की तरह भ्रूण के ऊतकों के निम्नलिखित लेजर पृथक रूप में अंग उत्थान मॉडल, के किसी भी संख्या के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है 46-49। अंत में, microbead आरोपण इस तरह के कैंसर 50,51 या ऊतक अध: पतन 52,53 के रूप में मानव रोग के मॉडल में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम भी इसी तरह अन्य शोधकर्ताओं द्वारा वर्णित है, लेकिन वीडियो प्रोटोकॉल 1 के माध्यम से नहीं दिखाया गया है जो zebrafish भ्रूण में microbead आरोपण, की विधि प्रदर्शित करता है। कम से कम अभ्यास के साथ हम शोधकर्ता कुछ अनुभव है एक बार इस प्रक्रिया की व्यवहार्यता से संबंधित है जो 8-10 भ्रूण की एक अनुमानित दर / घंटा, पर microbeads के प्रत्यारोपण करने में सक्षम थे। इस के साथ साथ दिखाया गया है परिणामों विभिन्न डी का मोती है कि का प्रदर्शनimensions प्रारंभिक चरणों में प्रत्यारोपित किया जा सकता है, और देखभाल के साथ कि, इस ऊतक हेरफेर तकनीक भ्रूण के लिए कम से कम शारीरिक विघटन के साथ लागू किया जा सकता है। जोर दिया जाना चाहिए कि एक सुधार भ्रूण में microbead की स्थिति के लिए एक गलमुच्छा / चाबुक उपकरण का इस्तेमाल होता है। उपकरणों का यह अपेक्षाकृत सस्ती और आसान टुकड़ा microbead रूप में एक ही व्यास के बारे में प्राप्त करने के लिए आसान है और आरोपण की प्रक्रिया में तेजी लाने में मदद करता है। गलमुच्छा / चाबुक शोधकर्ता निपुणता और पसंद पर निर्भर करता है, अभी तक नाजुक मनका-संभाल उपकरण एक फर्म का निर्माण करने के लिए एक वांछित लंबाई में कटौती की जा सकती है। हम यहां शारीरिक रूप से आरोपण प्रदर्शन करने के लिए microbeads और zebrafish भ्रूण हेरफेर करने के लिए कैसे वर्णित अंत में, जबकि, इस प्रोटोकॉल के विभिन्न दवाओं या पेप्टाइड्स के लिए विशिष्ट हैंडलिंग प्रक्रियाओं की रूपरेखा तैयार नहीं है। सामान्य में, रासायनिक उपचार microbeads जीव के अन्य क्षेत्रों में अवांछित प्रभाव से बचने के लिए, अवसरवादिता के साथ पशु में प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए, और शोधकर्ताओं में अच्छी तरह से किया जाना चाहिएअपनी पढ़ाई शुरू करने से पहले किसी भी तरह के रसायनों के साथ जुड़े संभव सुरक्षा चिंताओं के बारे में गठन किया था।
संक्षेप में, हम प्रयोगशाला में आसानी से उपलब्ध हैं कि सामग्री का उपयोग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एक अपेक्षाकृत सरल और कुशल microbead आरोपण विधि का प्रदर्शन किया है। अंत में, हम इस पुस्तिका zebrafish ऊतक में गड़बड़ी की नाजुक प्रकृति के साथ शोधकर्ताओं सहायता करेगा कि उम्मीद है।
The authors have nothing to disclose.
यह काम एनआईएच अनुदान DP2OD008470 द्वारा समर्थित किया गया।
Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
HEPES | Sigma Life Science | H4034 | |
Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333-20ML | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane) | Fluka Analytical | A5040 | |
Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
250mL Erlenmeyer Flask | Fischer Scientific | FB-500-250 | |
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile | Corning | 430167 | |
60mm x 15mm | VWR | 25373-085 | |
100mm x 15mm | VWR | 25373-100 | |
150mm x 15mm | VWR | 25373-187 | |
Saint-Gobain Chemware Microspatula | Fischer Scientific | 21-401-50B | |
P-1000 Micropipette tips | Fischer Scientific | 2707402 | |
Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
Dimethly Sulfoxide | American Bioanalytical | AB00435 | |
Microbeads (45-106 µm) | Biorad | 140-1454 AG1-X8 | |
Microbeads (45 µm) | Polysciences | 7314 | |
Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
Tungsten Needle | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6065 | |
Capillary tube holder | Globe Scientific Inc. | 51674 |