The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.
Zebrafisken er opstået som en værdifuld genetisk model for studiet af udviklingsmæssige biologi og sygdom. Zebrafisk deler en høj grad af genomisk bevarelse, samt ligheder i cellulære, molekylære og fysiologiske processer, med andre hvirveldyr, herunder mennesker. Under tidlig ontogeni, zebrafisk embryoner er optisk transparent, så forskerne at visualisere dynamikken i organogenesen hjælp af en simpel stereomikroskop. Mikroperle implantation er en metode, der muliggør væv manipulation gennem ændring af faktorer i det lokale miljø. Dette gør det muligt for forskerne at analysere virkningerne af et vilkårligt antal signalmolekyler af interesse, såsom udskilte peptider, på bestemte rumlige og tidsmæssige punkter inden det udviklende foster. Her har vi detaljeret en protokol for, hvordan man kan manipulere og implantat perler i den tidlige zebrafisk udvikling.
Udviklingsmæssige biologi forskere udnytte en bred vifte af cellulære, molekylære og genetiske metoder til at afdække de mekanismer, der styrer, hvordan en organisme er dannet. Blandt disse tilgange, væv manipulation er et centralt redskab i decifrere komplekse spørgsmål om celle skæbne, cellulær bevægelse, og tilrettelæggelsen af væv. En måde at ændre lokale væv miljøer er gennem kirurgisk anvendelse af mikroperler, der anvendes til at levere en fokal kilde til proteiner eller andre signalmolekyler 1. Denne type af eksperimentel manipulation er blevet bredt implementeret i klassiske hvirveldyr embryologi modeller, såsom frøen og chick 2.
Zebrafisken er blevet en vigtig hvirveldyr model organisme for studiet af organogenesen og giver også mange unikke fordele for sygdom modellering 3-5, da de deler høj genetisk bevarelse med mennesker 6. Især den optiske transparens og exekstern udvikling af zebrafisk embryo tilbyder en uovertruffen synspunkt til observation af væv ontogenese 3-5. Gennemførelsen af store forward genetiske skærme har genereret en kraftig repository af zebrafisk mutantstammer for yderligere undersøgelse 7,8, og identifikation af alternative screening teknikker, der effektivt kan udføres ved reduceret skala i enkelte laboratorier 9,10. Yderligere eksperimentelt arbejde med zebrafisk er blevet lettet gennem fremskridt inden transgene metoder og omvendt genetiske tilgange 11,12, samt kemiske genetik 13-15.
Tissue manipulation teknikker, såsom gennemførelsen af mikroperler, ikke har været så bredt anvendt i zebrafisk, men ikke desto mindre et nyttigt redskab til yderligere at forstå cellesignalering under udvikling. Mikroperle implantation er blevet anvendt til at udspørge de processer af dannelse orgel i zebrafisk nethinden16,17, hjerte 18, hjerne 19-22, neural crest 23 og fin 24,25. I disse og andre undersøgelser, har perler været anvendt under udviklingen at forstå udbredelsen af signalmolekyler 26, hvordan gradienter påvirker cellemigration 27 og aksial mønster 28. Mere for nylig er mikroperler blevet anvendt til at evaluere restitution mekanismer i zebrafisk voksne 29. I udviklingsmæssige undersøgelser, for eksempel, har zebrafisk microbead arbejde forudsat indsigt i mekanismerne i lemmer dannelse gennem studier af brystfinnen 25. Zebrafisk brystfinner fin opløbet er homolog til forben opløbet i musen 30 og chick 31. Hvirveldyrs knopskydninger har to væsentlige signalsystemer knuder: zonen med polariserende aktivitet (ZPA), der fastlægger den anteriore-til-posterior akse gennem ekspression af Sonic hedgehog (Shh) og nedstrøms Hox genmål,og den apikale ectodermale ryg (AER) til stede ved spidsen af knopskydninger, som virker til at etablere proximal til distal identitet af benet gennem ekspression af fibroblastvækstfaktorer (FGF'er). Ved at implantere Fgf gennemvædet mikroperler i zebrafisk Shh genetiske mutanter, efterforskere identificeret Fgf som afgørende for progression af cellecyklus og vækst i hvirveldyr lemmer 25. Ud over den FGF og Shh signalering kaskader, der etablerer positionel identitet, banebrydende undersøgelser under anvendelse af chick knopskydninger identificeret retinsyre (RA) som et molekyle, der kan efterligne virkningen af den polariserende region at etablere anterior til posterior identitet 32. Disse forsøg involverede at placere små strimler af RA-gennemblødt Whatman papir i chick lem at vurdere cifret mønsterdannelse 32. Yderligere har forskere udført andre elegante undersøgelser under anvendelse anvendelsen af mikroperler, celletransplantation, og exogentRA behandlinger i zebrafisk at fastslå, at RA virker til at levere langtrækkende positionelle signaler inden for zebrafisk baghjerne og mesoderm 28. På nuværende forbliver dog mange spørgsmål om roller signalering faktorer som Fgf og RA under mange aspekter af hvirveldyr udvikling. Signaleringen virkninger af RA, som en morfogen, påvirke mange organer 33, såsom udvikling af hjerte 34 og de renale stamceller hvor RA angiver proksimale nyreceller skrive skæbner 35-39. Yderligere forståelse af emner kunne drage fordel væsentligt fra eksperimentelle undersøgelser ved hjælp af væv manipulation og microbead implantation teknikker.
Mens færre undersøgelser er blevet udført med mikroperle implantation i zebrafisk, sammenlignet med modeller som chick, har de, der er blevet udført været yderst informativ. En årsag til den mangel på mikroperle implantation baseret-forskning i zebrafisk embryo er likely forestillingen om, at der er vanskelige tekniske udfordringer, baseret på størrelsen af embryonet, som udgør en hindring for vellykket udføre sådanne manipulationer. Dog kan microbead implantation i zebrafisk embryoner skal læres med praksis og assisteret ved visuel observation af teknikken, og derfor kan forfølges som et middel til at afhøre mekanismerne i udvikling. Her viser vi den præcise anvendelse af en mikroperle i zebrafisk embryo, som kan udnyttes til udførelse af en lang række forskellige assays på vævsdannelse og cellulær morfogenese.
I løbet af det sidste århundrede, har forståelsen af kroppens plan mønster og organogenesen gennemgået monumentale fremskridt. Tissue manipulation teknikker var kritiske i at afdække centrale oplysninger om disse vitale processer. Genetisk modifikation er en af de mest anvendte metoder til at fastslå genfunktion, og metoder til mosaik analyse, såsom celle transplantation, giver nyttige tilgange til at forstå autonomi genfunktion. Mikroperle implantation giver et andet sted at afhøre hvordan bestemte molekyler ændrer udviklingsmæssige dynamik, som denne metode gør det muligt for forskeren at ændre et lokalt væv miljø ved at indføre signalmolekyler eller inhibitorer. En række forskellige mikroperler er kommercielt tilgængelige, der har forskellig størrelse og andre fysiske egenskaber eksisterer (f.eks ladning), således at de kan anvendes til de eksperimentelle betingelser af interesse. Således, ved at implantere mikroperler, der er gennemvædet med et protein eller kemiskcal af interesse i en organisme, kan forskerne undersøge lokaliserede virkninger under udviklingen og finde associationer mellem genet eller molekyle af interesse og særlig biologisk fænotype (r).
Undersøgelser som den udføres af Wada og kolleger brugt mikroperle implantation for at vurdere effekten af øget Hedgehog signalering i skelet mønster i den forreste neurocranium (ANC) i zebrafisk 23. Tidligere undersøgelser har vist, at Shh er nødvendig for ANC formation 14. Ved hjælp Shh-coatede mikroperler forskere konstateret, at dette signal fremmer bruskdannelse i ANC. Mikroperlen implantation proces blev brugt til at vise en klar forbindelse mellem Hedgehog signalering og brusk dannelse i ANC. Observeres andet centralt eksempel på dette væv manipulation teknik zebrafisk i undersøgelser, hvor forskerne undersøgte transkriptionskontrol af Erythroblastoma Twenty-Six (ETS) domæne fskuespillere ETS-relateret molekyle (ERM) og polyomaenhanceren aktivator 3 (Pea3) ved Fgf signalering i den tidlige zebrafisk hjernens udvikling 19. Gennem mikroperle implantation eksperimenter, de var i stand til at vise, at FGF8 og Fgf3 ektopisk kan aktivere udtryk for erm og pea3. Disse eksempler illustrerer anvendeligheden af mikroperler at give indsigt i de udviklingsmæssige mekanismer, der samarbejder under vævsdannelse, som kan velkarakteriserede ved anvendelse af metoder til at vurdere genekspression 41. Således kan microbead transplantation være en levedygtig metode til at undersøge andre væv, såsom det mellemliggende mesoderm (IM), der giver anledning til nyren. Konkret vil det støtte i renale udviklingsmæssige undersøgelser, for at undersøge, hvordan forskellige molekyler påvirker nephron segmentering 42 og tubulogenesis 43,44, processer, der kun overfladisk forstået på nuværende tidspunkt. Endvidere har mikroperle implantation begyndt at blive anvendt til study restitution processer i zebrafisk 29] og kan tilpasses til anvendelse med et vilkårligt antal organregenerering modeller, såsom følgende laserablation af embryonale væv såsom nephron 45 eller i forbindelse med metoder, som er formuleret til at udføre forskning med de tilsvarende voksne strukturer 46-49. Endelig microbead implantation har potentialet til at blive anvendt i modeller for human sygdom, såsom cancer 50,51 eller væv degeneration 52,53.
I nærværende protokol, viser vi metoden til mikroperle implantation i zebrafisk embryoner som også er blevet tilsvarende beskrevet af andre forskere, men ikke vist gennem video-protokoller 1. Med minimal praksis kunne vi implantere mikroperler ved en omtrentlig hastighed på 8-10 embryoner / hr, som vedrører muligheden for denne procedure, når forskeren har en vis erfaring. De viste heri resultater viser, at perler af forskellige dimensions kan implanteres på tidlige stadier, og at med omhu, kan dette væv manipulation teknik implementeres med minimal fysisk forstyrrelse embryoet. Én forbedring, der skal understreges, er anvendelsen af en bakkenbart / lash værktøj til at positionere mikroperlen i embryoet. Denne relativt billig og enkel stykke udstyr er omtrent den samme diameter som mikroperle, er let at opnå og hjælper fremskynde implantation proces. Den whisker / lash kan skæres til en ønsket længde for at frembringe en fast endnu delikat perle-håndtering værktøj, afhængigt af forsker fingerfærdighed og præference. Endelig mens vi beskrev her, hvordan man fysisk manipulere mikrokugler og zebrafisk embryoner til at udføre implantation, denne protokol ikke skitsere specifikke håndtering procedurer for forskellige lægemidler eller peptider. Generelt bør kemisk behandlede mikroperler implanteres i dyret med hensigtsmæssighed, for at undgå uønskede virkninger på andre områder af organismen, og forskere skal være godt idannet om de mulige sikkerhedsproblemer forbundet med sådanne kemikalier inden initiering deres studier.
Sammenfattende har vi vist en relativt enkel og effektiv mikroperle implantation metode med en lang række applikationer, der anvender materialer, som er let tilgængelige i laboratoriet. I sidste ende håber vi, at denne manual vil hjælpe forskere med den fine karakter af zebrafisk væv manipulation.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud DP2OD008470.
Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
HEPES | Sigma Life Science | H4034 | |
Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333-20ML | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane) | Fluka Analytical | A5040 | |
Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
250mL Erlenmeyer Flask | Fischer Scientific | FB-500-250 | |
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile | Corning | 430167 | |
60mm x 15mm | VWR | 25373-085 | |
100mm x 15mm | VWR | 25373-100 | |
150mm x 15mm | VWR | 25373-187 | |
Saint-Gobain Chemware Microspatula | Fischer Scientific | 21-401-50B | |
P-1000 Micropipette tips | Fischer Scientific | 2707402 | |
Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
Dimethly Sulfoxide | American Bioanalytical | AB00435 | |
Microbeads (45-106 µm) | Biorad | 140-1454 AG1-X8 | |
Microbeads (45 µm) | Polysciences | 7314 | |
Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
Tungsten Needle | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6065 | |
Capillary tube holder | Globe Scientific Inc. | 51674 |