Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Tolerância imunológica em gestação é um período em que ocorrem alterações distintas dentro do sistema imunológico da mãe. Estas mudanças permitem que a mãe de tolerar o feto, um enxerto alogênico ^semi-1. O feto expressa complexo principal de histocompatibilidade paterna (MHC) ^2, e as células fetais têm sido encontrados na circulação materna ^3; Contudo, o feto não seja rejeitada ^4,5. Este enigma não é totalmente compreendido.

A hipótese mais recente indica que a tolerância materno-fetal é criado durante o coito e fecundação ^6,7 e mantido para manter uma gravidez completa ^8-10. A repartição deste tolerância materno-fetal é considerado um mecanismo de doença durante os estágios precoces e tardios da gravidez ^10-16. Tolerância materno-fetal envolve a participação de várias sub-populações de leucócitos, incluindo células T (células T reguladoras, células Th1, as células Th2 e células Th17), macrophages, neutrófilos, células mastro, células NK e células NKT, células dendríticas e células B, que a mudança em densidade e localização ao longo da gravidez ^15,17-19. Tolerância materno-fetal é enriquecido na interface materno-fetal ²⁰ – o local anatómico em que o sistema imune da mãe interage com os antigénios fetais ^20,21.

A interface materno-fetal é criado durante a placentação quando as células dos trofoblastos fetais extravilosas invadir a mucosa uterina ^22-24. No lado fetal desta interface, as membranas que envolvem o feto criar uma superfície epitelial especializado dentro da placenta, e as células de trofoblasto controlar a troca de nutrientes através do seu contacto directo com o sangue materno ^22. No lado materno da interface, a decídua recruta uma piscina heterogénea de leucócitos nos ratinhos que respondem por 30% a 50% de todas as células deciduais. Além de sua participação na Materntolerância imunológica al, estas células são principais contribuintes para diferentes processos durante a gravidez, por exemplo., a proteção do trato reprodutivo de infecções, fecundação, implantação do embrião ^7,25, angiogênese decidual ^26, remodelação vascular ^24,27, a invasão do trofoblasto ^28, placentária desenvolvimento ^24,25, e, em última análise, o trabalho de parto ^15,17. Por conseguinte, o estudo dos leucócitos envolvidas na tolerância materno-fetal é essencial para a elucidação da patogénese de complicações relacionadas com a gravidez.

Embora a utilização de imuno-histoquímica e imunofluorescência gerou dados para a visualização directa e localização de uterina, decidual, ou leucócitos da placenta ^29,30, análise de citometria de fluxo revelou mais subconjuntos específicos de leucócitos em cada um destes tecidos ^31,32. Além disso, citometria de fluxo foi utilizada para determinar a densidade e a proporção de maternal-fetal interface de leucócitos ³³ e expressão níveis de proteínas extracelulares e intracelulares ^8-10,34. Análise citométrica de fluxo de leucócitos na interface materno-fetal requer uma suspensão de célula única. A fim de isolar leucócitos infiltrantes do decidual, útero, placenta e tecidos, dois métodos de dissociação de tecidos têm sido usados: mecânica e enzimática. Os dois métodos permitem a separação de leucócitos infiltrados a partir da matriz extracelular (ECM) desses tecidos. Dissociação enzimática tecido é superior à dissociação mecânica do tecido, uma vez que permite uma maior produção de leucócitos associada com danos-cisalhamento-força inferior a ^35. Consequentemente, a dissociação do tecido mecânico exige a agregação tecidos ^36, que podem aumentar a variabilidade ea heterogeneidade das amostras. No entanto, a dissociação mecânica pode ser a escolha quando o antigénio de interesse pode ser alterada por dissociação enzimática ou quando a funcionalidade da célulaS de interesse devem ser preservados (por exemplo., a citotoxicidade de células NK) ^35.

O uso da proteólise com enzimas específicas para degradar a ECM elimina os rendimentos baixos observados com dissociação mecânica. Vários estudos têm relatado o uso de tripsina ^32, colagenase ^37, DNase ^31, Dispase ^38, e cocktails comerciais de várias enzimas ^32,39. No entanto, a natureza e concentração de enzimas diferentes e a duração da digestão deve ser cuidadosamente definida e validada, a fim de garantir a manutenção da integridade dos epitopos antigénicos de superfície celular necessárias para a imunofenotipagem. As várias estruturas de superfície são diferencialmente sensíveis à destruição por enzimas diferentes, com algumas enzimas, como a tripsina, sendo notório para a decapagem de epitopos de superfície de leucócitos reconhecidos por muitos anticorpos monoclonais.

Aqui introduzido é um método que utiliza um proteolytic e coquetel enzimático colagenolítica, chamado Accutase. Esta solução enzimática é suficientemente suave enquanto ainda eficaz na distinção entre tecidos murinos na interface materno-fetal, e não requer a adição de outros reagentes ou soro de dissociação para terminar a reacção de dissociação. Além disso, ela está pronta para uso imediato e, embora o tempo de dissociação deve ser validado, é mais robusta do que as enzimas acima mencionadas ^40,41.

A utilização de uma combinação de ambos os tipos de desagregação do tecido melhora a qualidade e quantidade de células obtidas; assim, vários estudos têm implementado o uso combinado de dissociação mecânica e enzimática com resultados satisfatórios ^31,32,37. O protocolo aqui descrito foi estabelecido e validado no nosso laboratório; utiliza uma combinação de uma dissociação mecânica suave seguido por uma desagregação enzimática robusta. Este protocolo permite o estudo de isolamento e mais deos leucócitos que se infiltram nos tecidos murinos na interface materno-fetal (útero, decidua, e placenta). O protocolo seguinte também mantém a integridade dos marcadores da superfície das células e rendimentos de células viáveis ​​suficientes para aplicações a jusante, como demonstrado por análise de citometria de fluxo. Finalmente, este protocolo mantém a consistência da preparação de células para análise e comparação dos diferentes tecidos de murino que compõem a interface materno-fetal.