In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren
Summary
To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.
Abstract
Um endovaskuläre Infektionen und Endokarditis führen, müssen Bakterien in der Lage, an der Gefäßwand, während sie mit der Schubspannung des strömenden Bluts ausgesetzt haften.
Um die Bakterien und Wirtsfaktoren, die zu Gefäß Adhäsion von Mikroorganismen beitragen zu identifizieren, werden geeignete Modelle, die diese Interaktionen unter physiologischen Scherbedingungen zu studieren benötigt. Hier beschreiben wir ein in-vitro-Strömungskammer Modell, das die bakterielle Adhäsion an verschiedenen Komponenten der extrazellulären Matrix zu untersuchen oder zu Endothelzellen ermöglicht und eine Intravitalmikroskopie Modell, das entwickelt wurde, um die anfängliche Adhäsion der Bakterien an die splanchnic Zirkulation in vivo direkt visualisieren . Diese Verfahren können verwendet werden, um die Bakterien und Wirtsfaktoren für die Adhäsion von Bakterien unter Strömung erforderlich identifizieren. Wir veranschaulichen die Bedeutung der Scherbelastung und die Rolle der von Willebrand-Faktor für die Adhäsion von Staphyaureus unter Verwendung von sowohl in vitro als auch in vivo-Modell.
Introduction
To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1.
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood.
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest.
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4.
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Scherbeanspruchung ist ein entscheidender Faktor für die vorzeitige bakterielle Adhäsion an der Behälterwand und zur anschließenden Erzeugung des endovaskulären oder endokardialen Vegetationen und metastatischen Infektionen 4,5. Wir beschrieben in vitro und in vivo Modellen komplementär zu der Pathogenese von endovaskulären Infektionen unter physiologischen Scherspannungs studieren. Diese Modelle haben uns erlaubt, von Willebrand-Faktor-bindendes Protein (vWbp) als Haupt S. identifizieren aureus Protein unter Fluss mit einer verletzten Gefäßwand frei VWF 4 interagieren.
Endovascular Infektionen und infektiöser Endokarditis sind insbesondere von Bedeutung, nicht nur weil der Sepsis-induzierten Organversagen und Tod, sondern auch wegen der lokalen und entfernten ("metastatic ') Komplikationen. Um infektiöse Endokarditis und metastatischen Infektionen verursachen, haben Bakterien an der Gefäßwand anhaften und somit Widerstand gegen die Scherspannung des strömenden Bluts. Am meistenUntersuchungen an Bakterien Virulenzfaktoren in statischen Bedingungen durchgeführt. Allerdings könnte diese etablierten Wechselwirkungen Scherkräfte und Untersuchungen nicht standhalten unter Strömungsbedingungen können neue, bisher nicht berücksichtigten Faktoren in Bakterien-Wirt Wechselspiel offenbaren.
Unter Verwendung der Mikrofließkammer parallel haben wir ua die Bedeutung der VWF für vaskuläre Haftung gezeigt. Unter Scherbeanspruchung, VWF schrittweise entfaltet sich aus seiner Ruhekugelförmiger Struktur und macht die A1-Domäne, die mit Thrombozyten über seine GPIb-Rezeptor 6 zusammenwirkt. Strömungskammern wurden ausgiebig verwendet werden, um die Thrombozytenfunktion 7 studieren.
Bemerkenswert ist, auch S. aureus Haftung unter Fluss erfordert VWF, insbesondere die A1-Domäne, die auf Scherung ausgesetzt ist. Wir identifizierten vWbp zu vermitteln VWF-Bindung. vWbp ist ein Koagulase, die auf S. trägt aureus Pathophysiologie durch Aktivierung des Hosts Prothrombin. Staphylothrombin, die resulting Komplex eines bakteriellen Koagulase und Prothrombin, wandelt Fibrinogen in unlösliches Fibrin 8,9. Unsere Studien haben gezeigt, dass nicht nur vWbp Prothrombin aktiviert, jedoch löst die Bildung von Bakterien-Fibrin-Blutplättchen-Aggregate, die die Haftung, die Blutgefäße unter Strömungs 4,10,11 verbessern.
Die In-vitro-Flusskammer-Modell ermöglicht es, die verschiedenen Akteure in die bakterielle Adhäsion an zellulären oder Matrixkomponenten zu studieren. Bakteriellen Virulenzfaktoren können mit Mutanten oder harmlose Bakterien zur Expression spezifischer Oberflächenproteine untersucht werden. Alternativ können pharmakologische Inhibitoren oder blockierende Antikörper gegen das Medium in der Strömungskammer zugegeben werden. Die Rolle von Wirtsfaktoren, wie beispielsweise unterschiedliche Bestandteile der extrazellulären Matrix können mit Deckgläsern mit verschiedenen Beschichtungen untersucht werden. Die Deckgläser kann auch mit Endothelzellen, deren Aktivierungsstatus kann durch Zugabe von spezifischen Stimulatoren moduliert werden abgedeckt. Apart aus der Gefäßwand, kann der Beitrag von Wirtszellen und Blutplasmaproteine durch Zugabe dieser Faktoren strömenden Mediums untersucht werden. So können verschiedene Bedingungen zunehmender Komplexität unter standardisierten Bedingungen laminarer Strömung untersucht, um die Interaktionen, die Bakterien an der Gefßwand in vivo anhaften lassen entwirren.
Wechselwirkungen in der in-vitro-Modell identifiziert werden anschließend in einem Tiermodell untersucht, um ihre Bedeutung in einem komplexen Organismus zu testen. Andere in vivo Modelle zur dynamischen Wechselwirkungen unter Strömungs studieren beschrieben, wie der Hamster Rückenhautkammer 12 und der Cremaster-Modell 13. Im Vergleich dazu ist das hier beschriebene mesenterica Perfusionsmodell bietet mehrere Vorteile aufgrund seiner Benutzerfreundlichkeit, die Möglichkeit zu variieren Host genetischen Hintergrund der Mäuse und pharmakologische Interventionen zu bewerten.
Im Ergebnis der beschriebenen Modellebieten die Möglichkeit, Oberflächenproteine nicht nur von S. studieren aureus, aber von vielen anderen Mikroorganismen in verschiedenen Host-Hintergründe, zum besseren Verständnis der Pathogenese von Gefäßinfektionen.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N unterstützt; "Eddy Merckx Research Grant" und die "Sporta Forschung Grant" für Pädiatrische Kardiologie, UZ Leuven, Belgien (JC); das Zentrum für Molekulare und Vaskuläre Biologie wird durch die Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), die von der "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (GOA 2009/13) von der Universität von Leuven und ein Forschungsstipendium von Boehringer Ingelheim.
Materials
| Brain Heart Infusion (BHI) | BD Plastipak | 237500 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Oxoid | CM0129 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-169 | D-PBS |
| 5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21878-25MG-F | fluorescent labeling |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roch | 10 735 086 001 | |
| Haemate-P | CSL Behring | PL 15036/0010 | VWF |
| Horm collagen | Takeda | 10500 | collagen |
| 1-well PCA cell culture chambers | Sarstedt | ######## | plastic slips |
| Temgesic | Reckitt Benckiser | 283716 | bruprenorphine |
| Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) | Eurovet | BE-V136516 | ketamin |
| XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) | VMD Arendonk | BE-V170581 | xylazine |
| 2 french intravenous catheter green | Portex | 200/300/010 | |
| 0,9% Sodium chloride (NaCl) | Baxter Healthcare | W7124 | |
| cotton swabs | International Medical Product | 300230 | |
| Ca2+-ionophore solution A23187 | Sigma-Aldrich | C7522-10 MG | |
| 26 gauge 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| 26 gauge 1 ml syringe with needle | BD Plastipak | 300015 | intra-peritoneal injection |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf | 5811 000.320 | |
| Glass cover slips (24×50) | VWR | BB02405A11 | Thickness No, 1 |
| PHD 2000 Infusion | Harvard Apparatus | 702100 | High-accuracy Harvard infusion pump |
| Axio-observer DI | Carl-Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
| ImageJ | National Institute of Health | Analysis software | |
| Graphpad Prism 5,0 | Graphpad Software | Analysis software | |
| AxioCam MRm | Carl-Zeiss | Black and white camera | |
Referenzen
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