in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、
Summary
To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.
Abstract
血管内感染症および感染性心内膜炎を引き起こすために、細菌は、血液の流れのせん断応力にさらされながら、血管壁に付着することができる必要があります。
微生物の血管接着に寄与する細菌と宿主因子を同定するために、生理学的剪断条件下で、これらの相互作用を研究する適切なモデルが必要とされています。ここでは、細胞外マトリックスの異なるコンポーネントに細菌の付着を調査するか、内皮細胞を可能にするインビトロフローチャンバーモデル、およびin vivoで直接内臓循環への細菌の初期接着を可視化するために開発された生体顕微鏡のモデルを記述します。これらの方法は、流れの下の細菌の付着のために必要な細菌と宿主因子を同定するために使用することができます。我々は、せん断応力の妥当性とStaphyの接着のためのフォンビルブランド因子の役割を示していますlococcus球菌の両方のin vitroおよびin vivoモデルで使用して。
Introduction
To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1.
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood.
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest.
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4.
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.
Protocol
Representative Results
Discussion
せん断応力は、血管壁への早期細菌付着および血管内または心臓内植生および転移性の感染症4,5の次の世代のための重要な要因です。我々は、生理的せん断応力下の血管内感染の病因を研究するためのin vitroおよびin vivoモデルで相補します。これらのモデルは、私たちは、主要なSとフォンビルブランド因子結合タンパク質（vWbp）を識別することができました球菌タンパク質はVWF 4を露出させ 、損傷した血管壁と流れの下で対話します。
血管内感染症、特に感染性心内膜炎は、だけでなく、ため、ローカルおよび遠隔（ '転移'）合併症の、ためだけでなく、敗血症誘発性の臓器不全と死の懸念されます。感染性心内膜炎および転移性の感染症を引き起こす細菌は、血管壁に付着し、したがって、血流の剪断応力に抵抗しなければなりません。最も細菌の研究が要因が静的な条件で行われてきた病原性。しかし、これらの確立された相互作用は、細菌宿主の相互作用に新たな、以前に認識されていない要因を明らかにすることができる流動条件下で剪断力と研究に耐えられない可能性があります。
マイクロパラレルフローチャンバーを用いて、他のものは血管接着用VWFの重要性を示しています。せん断応力下では、VWFは、次第にその静止球状構造から展開、およびそののGPIb受容体6を介して血小板と相互作用するA1ドメインを公開します。フローチャンバーは、広く血小板機能7を研究するために使用されています。
驚くべきことに、またS.流下球菌の付着は、剪断時に露出されるA1ドメインをVWFを必要とし、特に。我々は結合VWFを媒介するvWbpを同定しました。 vWbpは、Sに貢献コアグラーゼですホストのプロトロンビンを活性化することにより、 黄色ブドウ球菌の病態生理。 Staphylothrombin、RES細菌コアグラーゼとプロトロンビンとの複合体をulting、不溶性フィブリン8,9をフィブリンに変換します。我々の研究はvWbpがプロトロンビンを活性化するが、流れ4,10,11の下の血管への接着性を向上させる細菌フィブリン-血小板凝集物の形成をトリガするだけでなくことを示しました。
in vitroでのフローチャンバーモデルは、細胞またはマトリックスの構成要素に細菌付着で別の選手を研究することができます。細菌の毒性因子は、特定の表面タンパク質を発現する変異体または無害な細菌を用いて研究することができます。代替的に、薬理学的阻害剤または遮断抗体は、フローチャンバ内の培地に添加することができます。そのような細胞外マトリックスの種々の成分のような宿主因子の役割は、異なるコーティングでカバーガラスを使用して研究することができます。カバースリップは、また、活性化状態は、特定の刺激物質を添加することによって調節することができるそれらの内皮細胞で覆うことができます。アパ血管壁からのRTは、宿主の血液細胞および血漿タンパク質の寄与は流動媒体にこれらの要素を追加することによって調べることができます。したがって、複雑化の異なる条件は、細菌がin vivoで血管壁に付着することを可能にする相互作用を解明するために、層流の標準化された条件の下で研究することができます。
in vitroモデルで同定された相互作用は、その後、複雑な生物で、その妥当性をテストするために、動物モデルで研究されています。流れの下で動的な相互作用を研究するために、他のin vivoモデルは、ハムスターの背側皮下脂肪チャンバー12と精巣挙モデル13として、記載されています。対照的に、ここで説明する腸間膜灌流モデルは、可能性はマウスの遺伝的背景をホスト変えるためにおよび薬理学的介入を評価するために、その使いやすさのいくつかの利点を提供しています。
結論として、説明したモデルS.だけでなく表面タンパク質を研究する可能性を提供黄色ブドウ球菌が、別のホストの背景には多くの他の微生物の、より良い血管感染症の病因を理解します。
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、フォンVOOR Wetenschappelijk Onderzoek（FWO）ブラーンデレンG0466.10、11I0113Nによってサポートされていました。小児循環器、UZルーヴェン、ベルギーのための「エディ·メルクス研究助成」と「Sporta研究グラント」（JC）。分子および血管生物学のためのセンターは、ルーベン大学の「Geconcentreerde Onderzoeksacties」（GOA 13分の2009）とベーリンガーインゲルハイムからの研究助成金によって、Programmafinanciering KUルーベン（PF / 10/014）でサポートされています。
Materials
| Brain Heart Infusion (BHI) | BD Plastipak | 237500 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Oxoid | CM0129 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-169 | D-PBS |
| 5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21878-25MG-F | fluorescent labeling |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roch | 10 735 086 001 | |
| Haemate-P | CSL Behring | PL 15036/0010 | VWF |
| Horm collagen | Takeda | 10500 | collagen |
| 1-well PCA cell culture chambers | Sarstedt | ######## | plastic slips |
| Temgesic | Reckitt Benckiser | 283716 | bruprenorphine |
| Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) | Eurovet | BE-V136516 | ketamin |
| XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) | VMD Arendonk | BE-V170581 | xylazine |
| 2 french intravenous catheter green | Portex | 200/300/010 | |
| 0,9% Sodium chloride (NaCl) | Baxter Healthcare | W7124 | |
| cotton swabs | International Medical Product | 300230 | |
| Ca2+-ionophore solution A23187 | Sigma-Aldrich | C7522-10 MG | |
| 26 gauge 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| 26 gauge 1 ml syringe with needle | BD Plastipak | 300015 | intra-peritoneal injection |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf | 5811 000.320 | |
| Glass cover slips (24×50) | VWR | BB02405A11 | Thickness No, 1 |
| PHD 2000 Infusion | Harvard Apparatus | 702100 | High-accuracy Harvard infusion pump |
| Axio-observer DI | Carl-Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
| ImageJ | National Institute of Health | Analysis software | |
| Graphpad Prism 5,0 | Graphpad Software | Analysis software | |
| AxioCam MRm | Carl-Zeiss | Black and white camera | |
Referenzen
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