Phenomics فج: مقاربات الفسيولوجية لتوصيف رواية الفيروسية البروتينات
Summary
Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.
Abstract
التحقيقات الجارية في التفاعلات فج في استضافة تعتمد على استقراء المعرفة من (الفوقية) الجينوم. ومن المثير للاهتمام، 60-95٪ من كل فج تسلسل حصة لا تناظر للبروتينات المشروح الحالية. ونتيجة لذلك، يتم شرحها نسبة كبيرة من الجينات فج كما افتراضية. هذا الواقع يؤثر بشكل كبير على الشرح كل من جينات الأيض الهيكلية ومساعدة. نحن هنا نقدم طرق مظهري صمم للقبض على الاستجابة الفسيولوجية (ق) من مجموعة مختارة خلال التعبير عن واحد من هذه الجينات فج غير معروفة. وتستخدم متعددة النمط الظاهري الفحص لوحات (خرائط) لرصد تنوع استخدام الركيزة المضيفة وتشكيل الكتلة الحيوية لاحق، في حين توفر الايض تحليل ثنائي المنتج من خلال مراقبة وفرة الأيض والتنوع. وتستخدم كل من الأدوات في وقت واحد لتقديم لمحة المظهري المرتبطة تعبير عن فج المفترض إطار القراءة المفتوحة واحد (ORF). تتم مقارنة نتائج ممثلة لكلتا الطريقتين، HIGHLighting الاختلافات المظهرية الشخصي من مجموعة تحمل إما المفترضة الجينات فج الهيكلية أو التمثيل الغذائي. بالإضافة إلى ذلك، يتم عرض تقنيات التصور وإنتاجية عالية أنابيب الحسابية التي سهلت التحليل التجريبي.
Introduction
وتقدر الفيروسات التي تصيب البكتيريا (ويعرف أيضا باسم الجراثيم أو فج) في الوجود في أكثر من 10 31 فيروس مثل الجسيمات (VLPs) عالميا ويفوق عدد جميع الكائنات الحية الأخرى في بيئة 1،2. وركزت الدراسة الأولى metagenomic التحقيق في المجتمعات الفيروسية المرتبطة البيئات البحرية على قياس التنوع ينظر في جزء الفيروسي 3. بالإضافة إلى ذلك، وجد Breitbart وزملاؤه أن أكثر من 65٪ من تسلسل المجتمع الفيروسية المشتركة لا تناظر إلى أي تسلسل المتاحة في قواعد البيانات العامة. وجدت الدراسات metagenomic اللاحقة أدلة مماثلة: metagenomes من الرواسب البحرية في سان دييغو، كاليفورنيا تحتوي على 75٪ تسلسل الفيروسية مجهولة 4؛ metagenomes من البحيرات ذات الملوحة العالية للبحر سالتون تحتوي على 98٪ تسلسل الفيروسية المجهولة 5؛ وmetagenomes المرتبطة المرجانية تحتوي على 95-98٪ تسلسل الفيروسية مجهولة 6. وقد أدى هذا التراكم من المعلومات غير المشروحة فيفج المادة الوراثية بأنها "المادة المظلمة في الكون البيولوجي" (7).
توصيف الجيني من فج يعتمد على تحديد التشابه تسلسل من خلال المقارنة مع الأحماض والبروتينات قواعد بيانات النووية القائمة. لأن المعلومات الوراثية المشفرة فج هي في الغالب غير معروفة، وطرق القائم على التماثل غير فعالة. داخل الجينوم، وفاجات عادة ترميز ثلاثة أنواع رئيسية الجينات: النسخ والتكرار الجينات، الجينات التمثيل الغذائي، والجينات الهيكلية. وتشمل الجينات النسخ والتكرار (فئة I / II الجينات 8) بلمرة، primases، إندو / إكسو-nucleases، وتحركات. يتم حفظها هذه الجينات للغاية نظرا لأهميتها في الإصابة فج، الكتابة وتكرار فج المادة الوراثية. يتم تحديد بلمرة فج بسهولة باستخدام أساليب تناظر تسلسل التقليدية بسبب الحفظ العالمي من 9 ولقد ثبت لخدمة علامات النشوء والتطور فعالة إلى 10.في المقابل، فج التمثيل الغذائي والجينات الهيكلية (الطبقة II / III الجينات 8) بشكل متزايد متباينة، وغالبا ما المشروح في الجينات افتراضية.
فج جينات الأيض تؤثر على قدرة التمثيل الغذائي للمضيف وليس مطلوبا بالضرورة لتكاثر الفيروس. ويبدو أن هذه الجينات، وغالبا ما يشار إلى جينات الأيض المساعدة الى 11 (AMGs)، لتعديل التمثيل الغذائي المضيف والسماح التقدم الأمثل للعدوى ونجاح الفيريون النضج. وقد ارتبطت AMGs مع استخدام وامتصاص المواد الغذائية التي تحد أو في مسارات إنتاج الطاقة. وتشمل بعض الأمثلة الجينات الضوئي الموجودة في الجينوم من مختلف cyanophage 12-16، الجينات المتصلة والتي تنظمها استقلاب الفوسفات 17،18، والاستفادة من مسار الفوسفات البنتوز لفج dNTP الحيوي 18،19. في المقابل، الجينات الهيكلية من بين منتصف إلى أواخر الجينات التي تنتج أثناء العدوى وتختلف عبر مختلف فج حونظم الحادي والعشرين. إنتاج البروتينات الهيكلية تعتمد على توافر dNTP الفيروسي، وبرك الطاقة الخاصة بهم النسخ والترجمة، والتجمع 8. تعتبر البروتينات قفيصة والألياف ذيل هيكلية إذ أن معظم متباينة من كل جينات ترميز البروتينات الفيروسية وهناك حاجة لإنتاج الفيريون ناجحة. وعادة ما يعزى الاختلاف على الدور الفعال الذي تلعبه في تشكيل coevolution الفيروس في استضافة 20. البروتينات المختلفة، بغض النظر عن الطبقة الجينات، ويتم التغاضي بسهولة عند استخدام تقنيات التماثل والتوافق تسلسل التقليدية. وقد أدت محاولة لتصحيح القيود رأينا مع مقارنات تسلسل صارمة في أدوات المعلوماتية الحيوية قادرة على استخدام الخصائص تسلسل لتحديد تكوين الجمعيات، مثل الشبكات العصبية الاصطناعية 21. الشبكات العصبية الاصطناعية (الشبكات العصبية الصناعية) تسمح للتنبؤ الجينات الهيكلية والتمثيل الغذائي، ومع ذلك، تتطلب التحقق التجريبي المصب لتوصيف مباشرةوظيفة الجين.
والهدف من هذا المخطوط هو توفير بروتوكولات مظهري قادرة على رصد كل عملية الأيض تقويضي والمنشطة للبكتيريا المضيف خلال التعبير عن الجينات فج الرواية، وتوقع وظيفيا من خلال الشبكات العصبية الصناعية. مجال phenomics، البيولوجيا المرتبطة الظواهر الخلوية، راسخة في بيولوجيا النظم للمساعدة في التحقيق في البروتينات مع وظيفة غير معروفة أو عديد المظاهر. وتستخدم أدوات مظهري لربط المعلومات المظهرية على المعلومات الوراثية. نحن نفترض للجينات فج المفترضة أن وظيفة (ق) يمكن تحديدها من خلال مراقبة المضيف الآثار الفسيولوجية خلال التعبير فج الجينات. للتحقيق في هذه الفرضية، وقد تم اختيار اثنين من الأساليب الكمية. واستخدمت متعددة النمط الظاهري الفحص لوحات (خرائط) لمراقبة المضيف استخدام الركيزة وتشكيل الكتلة الحيوية لاحق في حين الايض قياس التنوع الأيض المضيفة والوفرة النسبية خلال النمو في البيئى محددةالظروف النفسية. تم overexpressed البروتينات الهيكلية والتمثيل الغذائي المفترضة في القولونية وتتم مقارنة نتائج ممثلة من كل التجارب. يتم عرض تقنيات بصرية عديدة وخطوط الأنابيب وتجهيز إنتاجية عالية لتسهيل النسخ التجريبية. وأخيرا، وتناقش استنساخ ودقة الأساليب المعروضة في سياق الآثار الفسيولوجية المتوقع للبروتين المشروح قفيصة وفج البروتين الأيض، thioredoxin، بالإضافة إلى اثنين AMGs المفترضة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نقدم النهج مظهري لتوصيف وظيفي من الجينات فج المفترضة. وتشمل تقنيات مقايسة المتقدمة قادرة على رصد المضيف الابتنائية التمثيل الغذائي، لوحات متعددة النمط الظاهري الفحص (خرائط)، بالإضافة إلى الطريقة المتبعة في الايض، قادرة على قياس التأثيرات على الأيض تقويضي. قدمنا أدوات إضافية لإدارة مجموعات كبيرة من البيانات الناتجة عن هذه التكنولوجيات، مما يسمح لارتفاع تجهيز الإنتاجية وتحليل 24. وأخيرا، من خلال مقارنة مشروحة البروتين فج قفيصة، فج thioredoxin، وهما المفترضة الجينات فج التمثيل الغذائي، ومتوسط استجابة التجريبية نقترح استراتيجيات مختلفة لتفسير كل من مجموعات البيانات والطبقات الجينات، مع التركيز على تحديد الاتجاهات المظهرية وتحديد القيم المتطرفة.
كما ذكر، كلا النهجين قياس كميا فقط نصف الأيض المضيف. لتفسير وظيفة النسبية لأي منبروتينات جديدة قيد التحقيق، والبيانات المطلوبة من كل وسائل لتقديم أدلة على وظيفة. في حين أن هذا ليس محور مخطوطة الحالية لدينا، يتم وضع مخرجات البيانات من كل طريقة مظهري من خلال التحليلات توفيقية التي تركز على تقنيات التجميع مثل الغابات العشوائية وتحليل المكون الرئيسي. وعلاوة على ذلك، الفرضيات الناتجة عن تحليل مجتمعة يجب التحقق من صحة وقت لاحق منهجيات الوراثية التقليدية.
أخيرا، تتأثر بشكل كبير من قبل علم وظائف الأعضاء البكتيرية وبالتالي اتباع نفس المعايير الأساليب المقدمة. عند القيام إما الأسلوب، تحتاج الاعتبارات التي يتعين بذلها لضمان، وجربت مع مجموعة نسيلي مستقلة. يتم منع التلوث. ويجري اختبار متغير واحد. ويجري ركض الضوابط المناسبة في وقت واحد. وفشل لحساب هذه النقاط يؤدي إلى نتائج غير واضحة، على غرار أي فحص الفسيولوجية.
متعددة النمط الظاهري لوحات الفحص(خرائط)
وضع خرائط توفر إنتاجية عالية وفحص قدرة على التكيف بالمقارنة مع التكنولوجيات المتوفرة حاليا (الشكل 5A والجداول 1،2). يستخدم فحص اللوازم والمعدات والتقنيات الأساسية متوفرة في جميع مختبرات الأحياء المجهرية. إدراج خط أنابيب الحسابية، PMAnalyzer 24، لمعالجة البيانات وتحليلها لاحقا يضمن تفسير البيانات السريع. بالإضافة إلى ذلك، على حد سواء الجوانب التجريبية والتحليلية للنهج يمكن تعديلها بسهولة أو ضبطها لأغراض مخصصة. على سبيل المثال، إذا فشل نسبة كبيرة من البيانات لتمرير الترشيح الواردة في الباب 4، يمكن للمرء أن تدقيق يدويا من خلال منحنيات النمو لتحديد القضايا. إذا المشكلة تنشأ بسبب المعلمات تصفية صارمة، ويمكن إجراء تعديلات على السيناريو. بدلا من ذلك، إذا ترتبط مشاكل مع عملية التجريبية (أي التكثيف لفترات طويلة؛ وتحويل غير لائق من سل البكتيريةليرة سورية، وما إلى ذلك) ثم مكررات إضافية يمكن أن تتكرر بسهولة.
كما هو موضح في كويفاس وآخرون 24، PMAnalyzer هو برنامج باش واحد كما هو مكتوب نصي المجمع الذي ينفذ تحليل وتحليل النصوص بمثابة خط أنابيب متماسك الآلي. جميع النصوص يمكن الوصول إليها بحرية من بوابة مستودع في 25 بأخذ القيمة الوسطية لكل نقطة زمنية عبر البيانات ثلاث نسخ، وparameterizes في وقت لاحق منحنى اللوجستي للحصول على الوقت الضائع، ومعدل النمو الأقصى، الخط المقارب، ومصطلح الرواية، ومستوى النمو. وقد تم اختيار قيمة متوسط فوق المتوسط في دراستنا للحد من تأثير القيم المتطرفة الكبيرة، ومع ذلك، فإن السيناريو يمكن أن تتكيف بسهولة لحساب متوسط البيانات تكرار. نظرا لانخفاض التباين (SE) ينظر عبر البيانات تكرار (الشكل 2A) حافظنا على استخدام المتوسط في PMAnalyzer لتركيب منحنى اللوجستي. بالإضافة إلى ذلك، قطع للنمو في هذه الدراسة (GL ≥ 0.4) كان DETErmined بمقارنة كيفية فصل البيانات عبر مستوى النمو ومعدل النمو الأقصى (الشكل 1A، B). اعتمادا على نظام الصكوك والنموذج المستخدم قد تختلف هذه المدة، الأمر الذي يتطلب إعادة تعريف هذه بقطع القيمة.
والميزة الرئيسية لفحص لدينا القدرة على المقارنة بين الظواهر باستخدام معلمة واحدة تميز نمو الجراثيم العام، وهو ما نعرفه مستوى النمو (GL). GL هو الوسط التوافقي، وبالتالي يخفف من آثار القيم المتطرفة الكبيرة في البيانات. استخدام الوسط التوافقي مع القيم المجهزة لوجستية تحول لتوفير ووصل ملخص للنمو في خلال التجربة والخطأ. حاولت وسائل أخرى للتمييز وتضمن النمو: الوقت الذي استغرقته للوصول إلى معايير محددة منحنى (μ نصف كحد أقصى، μ كحد أقصى، والقدرة على التحمل)، ومعامل التحديد (R 2)، ومجموعات من R 2 مضروبا المعلمات منحنى محددة. باستخدام الوسط التوافقي مع تحولقدمت القيم اللوجستي مناسبا لGL أكبر مجموعة في تقييم النمو، وبالتالي فإنه أصبح الأسلوب المفضل. نظر احد هو أن نلاحظ أن دينامية أنماط منحنى النمو لديها القدرة للضياع عند استخدام معلمة واحدة أو نموذج المجهزة. على سبيل المثال، المعلمات منحنى الفردية المنحنى اللوجستي وGL عاجزة عن ما يمثل نموا ثنائي الطور. في بيئة واحدة من الكربون، وهذا أثر على النمو يعني وساطة من البروتين الفيروسي على أي تحويل الركيزة أو التحول في استخدام الركيزة. آثار إضافية محتملة فقدت عندما لا تفكر المعلمات نمو متعددة وتشمل: المطول الوقت الضائع، واقتراح زيادة العبء على الآلات والمنتجات الفيروسية. تسريع بسرعة المرحلة الأسية، مما يشير إلى البروتينات الفيروسية بالإضافة إلى استضافة مسارات إنتاج الطاقة؛ المستويات أو أعلى من تشكيل الكتلة الحيوية، مما يعني دعم الفيروسي في امتصاص المواد الغذائية المضيفة وتحريض استقلاب (لا تظهر البيانات). وبالتالي، بالتآمر منحنيات النمو الوليدة ( <stرونغ> الشكل 2A، B) يقدم معلومات بشأن الاتجاهات على مر الزمن في حين أن GL يأخذ في الاعتبار المتغيرات الرئيسية لنموذج اللوجستي، وتوفير عدد الكمي واحد لتمثيل النجاح الشامل للاستنساخ.
عند النظر في استجابات مختلفة ساهم الجينات الهيكلية والتمثيل الغذائي في الخرائط، لوحظ أن فصول الركيزة مختلفة في مسألة توفير أكبر دليل على وظيفة البروتين. على سبيل المثال، غالبا ما ترتبط بروتينات الأيض مع اكتساب الحد من المواد الغذائية، والتي هي غير محددة لاستضافة المركزي 16،32 الأيض. تكشف التجارب MAP الأولية أن الحيوانات المستنسخة إيواء المفترضة الجينات فج الأيض لديها مرحلة متخلفة زيادة عندما نمت على مصادر الأيض الكربون المركزية (الشكل 2A). على العكس، استنساخ تحمل الجينات الهيكلية المفترضة، والتي تتطلب نسب كبيرة من أحواض الطاقة المضيفة وdNTP، يؤدي إلى استجابة إيجابية كاذبة على نمو المائةركائز عملية التمثيل الغذائي الكربون راؤول والأحماض الأمينية. هذا هو الأرجح بسبب تراكم البروتينات غير قابلة للذوبان مما أدى إلى filamentation المضيف و / أو هيئات إدراج، كما لوحظ من خلال الفحص المجهري (الشكل 2A و لا تظهر البيانات). في حين أن المطلوب مزيد من التحليل للتحقق من صحة هذه النتائج الأولية، والخرائط قادرة على استرجاع الردود المظهرية التي ترتبط إلى الافتراض ظائف الطبقات فج جين معين.
بالإضافة إلى توضيح من البروتينات الفيروسية مجهولة، والخرائط مورد رواية للتحقيق في التنوع الوظيفي والتمثيل الغذائي للبكتيريا فرد أو جماعة من البكتيريا. تم تصميم مكونات خطة لتغيير السهل لدعم نمو مجموعة واسعة من البكتيريا. بما في ذلك الميكروبات اللاهوائية البحرية والعوز الغذائي، و. لتسهيل هذه الجهود القاعدية وقبل نمو وسائل الاعلام محددة تتطلب الأنواع الكيميائية إضافية أو تعديلها قبل أن تتمكن من دعم جنس البكتيرية المختلفة في الخرائط.ملاحظة واحدة في هذا الاستخدام للخرائط هو الحفاظ على وسائل الاعلام محددة، حظر استخدام مكونات مثل تريبتون، خلاصة الخميرة والبيبتون.
الايض
مجال الايض يعتمد على قواعد بيانات الأيض، والتي تشمل نواتج معزولة التي حددها مطياف الكتلة. مرفق الأساسية المختارة هنا لديه واحدة من أكبر قواعد البيانات الايض. ومن المثير للاهتمام، كان أكثر من نصف الأيضية الناتجة عن التجريب لدينا هويته (~ 65٪)، في حين أن آخرين لم يسبق أن سجلت في مضيفنا، الإشريكية القولونية (تشمل الأمثلة على ذلك: إندول حمض الخليك 3 33، حمض الصفصاف 34، وحمض dihydroabietic 35). ويمكن أن يعزى هذا الواقع إلى أي تحيز قوي من قاعدة البيانات نحو الأيض النباتية، أو بروتينات معينة قيد التحقيق. بغض النظر، والنتيجة هي عدد محدود من المركبات المعروفة المتاحة لتمثيل البيانات وتحليلها. في فوتلح، فإن الوسائل الايض متعددة باستخدام قواعد بيانات مختلفة تسمح لتغطية أكبر الأيض.
في الوقت الحاضر، معروفة وتستخدم نواتج غير معروفة عند مقارنة والمتناقضة لدينا البروتينات الفيروسية الجديدة على حد سواء. باستخدام هذا النهج، ونحن نفترض أن الحيوانات المستنسخة إيواء بروتينات مماثلة وظيفيا وتبادل تشابه زيادة في التعريف metabolomic التام عليها. وكشف تحليل الايض الأولي أنه في حين أن الجينات الهيكلية والتمثيل الغذائي لا تفصل بوضوح عن بعضها البعض، تلك الجينات نستعرض آثار مماثلة على المضيف عندما overexpressed لا ربط (الشكل 6). على سبيل المثال، مجموعات الجينات قفيصة مشروحة بشكل وثيق مع جينات الأيض المفترضة سلط عليها الضوء في هذه الدراسة، EDT2440 وEDT2441. وأظهرت التحقيقات باستخدام طوبولوجيا الغشاء وإشارة الببتيد البرنامج مؤشرا للجمهور دليل على أن كل من جينات الأيض المفترضة تؤوي مجال الغشاء واحد. ومن المثير للاهتمام 5 من أصل عشروتوقع ه 9 الحيوانات المستنسخة في نظام المجموعة الأولى (الأكثر ترك جزء من dendrogram) المجالات عبر الغشاء باستخدام برنامج طوبولوجيا نفسه. وهناك حاجة إلى مزيد من التحقيقات، ومع ذلك، فمن المرجح أن الأيض الحالية خلال overexpression من هذه الحيوانات المستنسخة ترتبط مع الاستجابة للضغط النفسي الخلوية الناتجة عن غشاء أو أعباء الهيكلية. هذا دليل يدعم ذلك في حين أن البيانات الايض يملك زيادة كمية الضجيج، فإن هذه الطريقة قادرة على تسليط الضوء على الإشارات التي تميز الآثار العامة من الجينات، داخل وعبر فئة الجينات على حد سواء. لتحديد ما إذا كان أسلوب قادر على استخراج أية معلومات محددة وظيفة الجين، تم تجميع نواتج الأيض في المسارات الأيضية محددة. الفرضية يكون، إن استنساخ يؤثر نواتج محددة لمسار واحد، ثم الجين overexpressed نشط في هذا الطريق. قبل إنشاء خط أنابيب لضمان الجودة الايض لدينا، وكشفت البيانات الأولية إلى أن أكثر منوكانت الأيض ممثلة تمثيلا ناقصا د عادة "غير معروف"، وتوفير معلومات قليلة عن مسارات فإنها ترتبط مع (لا تظهر البيانات). البيانات الايض Preprocessed، ومع ذلك، تبين أن اغلبية من لمحات الأيض متشابهة وفقط عدد مختار من وفرة الأيض غير معروفة ومعروف تختلف باختلاف الحيوانات المستنسخة، على سبيل المثال بوتريسين واليوراسيل (الشكل 6). لتوفير قدر أكبر من الدقة من جهود وظيفة البروتين تبذل لمقارنة بالتجربة الجينات فج جديدة ضد الجينات فج المعروفة، والتي يمكن استخدامها لملء في "الثقوب" من المستقلب أساس توصيف وظيفي. باستخدام هذه التقنية، الوظيفة المعينة من الجينات الفيروسية المعروفة توفر مرجعا لوظيفة الجينات مجهولة. ومع ذلك، فإن العوامل التي تحد من تحليل metabolomic هو حجم وأهمية قاعدة البيانات. لتصحيح هذه القيود، وقواعد البيانات metabolomic relatable لهذا البحث تحتاج إلى وضعها؛ مثلكقاعدة بيانات الأيض وفرة المحددة لجمع ASKA من E. استنساخ القولونية التي هى overexpressed على ORF واحد 36. وقدمت دليلا على الحاجة إلى قواعد البيانات هذه في عام 2013 عندما الباحثين في مختبر بيركلي الوطني ورنس تجميع أول قاعدة بيانات شاملة للنواتج محددة للمكتبات متحولة كاملة من البكتيريا نموذج 37. قدم هذا البحث رؤية جديدة في الجينات اللازمة لاستخدام نواتج محددة، وكشف عن صلة واضحة بين النمط الظاهري والتركيب الوراثي.
عند النظر الايض كأداة، فمن المهم أن تحدد اتباع نظام المعالجة في منشأة الأساسية. قطعة أثرية من معظم الإجراءات التجريبية هي التباين يوما بعد يوم المرتبطة صكوك الاستخدام. حتى الآن كل تحليل GC-MS بتطبيق استخدام المعايير الداخلية التي تم تضمينها في كل شوط التحليلي. ومع ذلك، بالإضافة إلى عينات الداخلية الخاصة بالمشروع </ م> ركض كل يوم من التجريب يزيل التباين إضافية. يجب أن تعالج هذه الاعتبارات في وقت مبكر لتفادي مشاكل التطبيع والتحيز. حل آخر هو لمعالجة جميع العينات في منشأة الأساسية على نفس الجهاز وكما دفعة واحدة، وهو خيار متاح في أي مرفق الأساسية.
ومختلف الأدوات التي أدخلت على حد سواء وإعادة استكشافها في هذه المخطوطة تقديم رواية تعني أن يحجب وتوصيف الجينات فج غير معروفة وظيفيا. البساطة والقدرة على التكيف من أساليب فنية تجريبية مع استخدام تبسيط خطوط الأنابيب الحسابية تؤكد هذه الأساليب هي التي تنطبق على مجموعة واسعة من الأنشطة البحثية والمجالات. هدفنا هو أن النهج مظهري المقدمة هنا سوف تساعد مزيد من التحقيقات من البروتينات فج جديدة بالإضافة إلى الأنظمة التي هي على حد سواء غير معروف وظيفيا.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas, and members of the Viral Dark Matter consortium for their help and constructive input on this manuscript. This research is funded by the National Science Foundation (DEB-1046413) and is part of the Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter project.
Materials
| 0.22µm Sterivex Filter | Fisher Scientific | SVGP01050 | Millipore |
| 0.22µm Millex Filters | Fisher Scientific | SLGV033RS | Millipore |
| 0.22µm SteriCap Filter | Fisher Scientific | SCGPS02RE | Millipore |
| 0.22 µm Omnipore membrane filters | Millipore | JHWP02500 | Millipore |
| 96 well micro-titer plates | VWR | 82050-764 | Standard F-Bottom 96 well Microplates |
| 2 mL 96 well plate | Fisher Scientific | ||
| Adhesive Seal Plate Film | Sigma-Aldrich | Z369667 | |
| 2 L Nalgene square bottles | Cole Parmer | T-06040-70 | |
| 125 mL Nalgene square bottles | Cole Parmer | T-06040-50 | |
| 1/4inch Panel Mount Lock Nut, black nylon | Cole Parmer | EW-45509-04 | |
| Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb 1/16inch | Cole Parmer | EW-45500-30 | |
| Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb, 1/8inch | Cole Parmer | EW-45500-34 | |
| Male Luer Integral Lock Ring to 500 Series Barb, 1/16inch ID tubing | Cole Parmer | EW-45505-31 | |
| Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler | Cole Parmer | T-45508-80 | |
| Barbed Bulkhead Fittings 1/4inch OD | Fisher Scientific | 6149-0002 | |
| Sanipure Tubing 1/16inch ID x 1/8inch OD | SaniPure | AR400002 | |
| Sanipure Tubing 1/4inch OD x 1/8inch ID | SaniPure | AR400007 | |
| Variable Flow Mini Pump (Peristaltic pump) | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Magnetic Stirrer | Velp Scientifica | F203A0160 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 14-512-141 | Millipore* Filter Forceps |
| Multi-plate spectrophotometer plate reader | Molecular Devices Analyst GT | ||
| Filter manifold | Fisher Scientific | XX10 025 02 | |
| Software: | |||
| Python version 2.7.5 | http://www.python.org/ | ||
| PyLab module | http://wiki.scipy.org/PyLab | ||
| R version 3.0.1 | http://www.r-project.org/ | ||
| reshape2 library | http://had.co.nz/reshape | ||
| ggplot2 library | http://ggplot2.org/ | ||
| Gene Composer | PSI Tech Portal | http://www.genecomposer.net | |
| Services: | |||
| West Coast Metabolomics Center | UC Davis | http://metabolomics.ucdavis.edu | |
| DNA 2.0 | https://www.dna20.com |
Referenzen
- Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).
- Hendrix, R. W. Recoding in Bacteriophages. Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).
- Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
- Breitbart, M., et al. Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).
- Dinsdale, E. A., et al. Functional metagenomic profiling of nine biomes. Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).
- Vega Thurber, R. L., et al. Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).
- Pedulla, M. L., et al. Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes. Cell. 113 (2), 171-182 (2003).
- Calendar, R., Abedon, S. T. . The bacteriophages. , (2006).
- Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences. FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).
- Klenk, H. -. P., Palm, P., Zillig, W. DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules. Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).
- Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses. Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).
- Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus. Nature. 424 (6950), 741 (2003).
- Mann, N. H., et al. The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains. Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).
- Lindell, D., et al. Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).
- Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).
- Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations. PLoS biology. 3 (5), e144 (2005).
- Rohwer, F., et al. The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages. Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).
- Miller, E. S., et al. Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage. Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).
- Thompson, L. R., et al. Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).
- Paterson, S., et al. Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution. Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).
- Seguritan, V., et al. Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins. PLoS computational biology. 8 (8), e1002657 (2012).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture Medium for Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).
- Cuevas, D. A., et al. Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles. F1000Research. , (2014).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets. BMC bioinformatics. 11, 341 (2010).
- Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).
- Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PloS One. 6 (3), e17288 (2011).
- Welch, M., et al. Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli. PloS One. 4 (9), e7002 (2009).
- Fiehn, O., et al. Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies. The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).
- Zeng, Q., Chisholm, S. W. Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation. Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).
- Shindy, W. W., Smith, O. E. Identification of plant hormones from cotton ovules. Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).
- Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. Biosynthesis and metabolism of salicylic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).
- Chappell, J. The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism. Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).
- Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research. DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).
- Baran, R., et al. Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype. ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).
