Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em> Coxiella burnetii</em> Mutants de transposon

1. La génération d'une banque de mutants de transposon Coxiella GFP étiqueté Manipuler Coxiella burnetii RSA439 NMII dans un niveau de confinement 2 de biosécurité (BSL-2) dans une enceinte de sécurité microbienne (MSC) en conformité avec les règles locales. Si compatible avec le modèle bactérienne utilisée, répétez les étapes à partir de 1.4.1 à 1.4.4 pour augmenter la probabilité d'obtention de mutants clonales. Une banque de mutants typique est composé (au moins) d'un certain nombre de mutants qui est égale à trois fois le nombre de séquences annotées dans le génome de l'organisme utilisé codage. Préparation de électrocompétente Coxiella RSA439 NMII: Préparer 1x ACCM-2 13: 13,4 mM d'acide citrique, le citrate de sodium 16,1 mM, phosphate de potassium 3,67 mM, chlorure de magnésium 1 mM, 0,02 mM de chlorure de calcium, mM sulfate 0,01 de fer, le chlorure de sodium 125,4 mM, 1,5 mM de L-cystéine, 0,1 g / L Bacto Neopeptone, 2,5 g / l de casaminoacides, 1 g / L méthyle bêta cyclodextrine, 125 ml / L RPMI. Ajuster le pH à 4,75 et stériliser par filtration (ne pas autoclaver). Remarque: Liquide ACCM-2 est stable à 4 ° C pendant environ 1 mois. Inoculer 100 ml d'ACCM-2 avec 2 x 10 6 génome équivalent (GE) / ml de Coxiella RSA439 NMII (à partir d'un stock bactérienne préalablement généré et quantifiés comme dans l'étape 1.5) à partir des stocks C -80 ° et distribuer la suspension bactérienne dans 75 cm 2 cellules des flacons de culture avec des bouchons ventilés (10 – 15 ml de suspension bactérienne par flacon). Croître pendant 7 jours à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 et de 2,5% d'O 2. Piscine La suspension bactérienne résultant en tubes de 50 ml et centrifuger à 3900 g pendant 1 h à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre le culot dans 30 ml de 10% de glycérol. Centrifuger à 3900 g pendant 1 h à 4 ° C. Remettre en suspension le culot dans un volume suffisant de glycerol à 10% (typiquement 2 ml) et 50 aliquote de 500 pl dans des tubes ul. Gardez b remis en suspensionacteria sur la glace pendant tout le processus. Remarque: A ce stade, les bactéries sont électrocompétente et une aliquote est suffisante pour effectuer une électroporation. Les suspensions bactériennes peuvent être conservés à -80 ° C pendant 6 mois ou être utilisées directement pour l'électroporation de l'ADN plasmidique. Électroporation de Coxiella compétente transposon- et les plasmides de transposase codant: Remarque: pour le protocole suivant, l'élément transposable et la transposase sont codées par deux plasmides différents (PITR-CAT-GFP et pUC19-Himar1C9, respectivement) 7. Les deux plasmides ont pas une origine de réplication spécifique à Coxiella, ce qui en fait des plasmides suicides lorsque électroporé dans Coxiella. Cela garantit insertions de transposons stables. L'élément transposable contient une cassette de résistance au chloramphénicol sous la régulation du promoteur p1169 Coxiella pour la sélection et le gène de la GFP sous la régulation du promoteur p311 Coxiella pour marquer les mutants générés avec GFP. Pre-refroidir une cuvette d'électroporation de 0,1 cm pendant 10 min sur de la glace. Mélanger 50 pi de électrocompétente Coxiella avec 10 ug transposon plasmide et 10 ug de plasmide transposase 7. Assurez-vous que la concentration de plasmide est supérieure à 500 pg / ml afin de minimiser la dilution du glycérol. Électroporation en utilisant la configuration suivante: 18 kV, 500 Ω, 25 pF. Assurez-vous que la constante de temps résultante est comprise entre 9 et 13 msec. Immédiatement ajouter 950 pi de RPMI, remettre en suspension les bactéries électroporation et les transférer dans un tube à bouchon à vis et conserver à la température ambiante. Prendre 200 ul des bactéries électroporées et à ajouter 3 ml d'ACCM-2 supplémenté avec 1% inactivé par la chaleur de sérum bovin fœtal (FBS) dans des plaques à 6 puits. Ajouter 88 pi de DMSO pour le volume restant de bactéries électroporées (pour atteindre une concentration finale de 10% de DMSO) et conserver à -80 ° C. La sélection des mutants de transposon: Incubate des plaques à 6 puits inoculés comme décrit ci-dessus (1.2.4) pendant une nuit à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 et de 2,5% d'O 2. Ajouter les antibiotiques appropriés (375 ug / ml de kanamycine ou 3 ug / ml de chloramphenicol). Incuber la culture bactérienne pendant 3 jours supplémentaires dans les conditions décrites ci-dessus. Isolement de mutants individuels: Préparation de solides ACCM-2 plaques et le placage de mutants de transposons Coxiella Remarque: Les instructions suivantes sont pour une boîte de Pétri, plusieurs dilutions de cultures bactériennes doivent être testés pour évaluer le volume d'inoculation optimale pour l'isolement de la colonie. Chauffer 10,5 ml de 0,5% d'agarose dans un micro-ondes et laisser refroidir dans un bain d'eau à 55 °. Chauffer 11,25 ml de 2x ACCM-2 (pH 4,75) à 37 ° C. Préparer agarose bas: Mélanger 10 ml de 0,5% d'agarose fondu avec 10 ml de 2x-2 ACCM et ajouter les antibiotiques appropriés (375 ug / ml de kanamycine ou 3ug / ml de chloramphenicol). Verser immédiatement dans la boîte de Pétri. Gardez le plat unlidded Petri, laisser refroidir moyen pendant 30 min et sécher à l'air pendant 20 min. Préparer top agarose: Mélanger 1,25 ml de 2x ACCM-2 avec 0,75 ml d'eau dans un tube 5 ml de polystyrène, ajouter les antibiotiques appropriés (375 ug / ml de kanamycine ou 3 ug / ml de chloramphenicol) et incuber à 37 ° C. Ajouter la culture bactérienne (typiquement de 1 à 100 ul) et vortex pendant 5 s. Ajouter 0,5 ml d'agarose fondu, mélanger et verser immédiatement sur le agarose bas. Laisser refroidir pendant 20 min, remettre le couvercle sur la boîte de Pétri et incuber à 4 ° C pendant 20 min pour faciliter la solidification agarose. Sécher à l'air pendant 20 min dans un unlidded MSC. Cultiver les plaques à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 et de 2,5% d'O 2 pendant 6 à 7 jours. Ajouter du DMSO pour les bactéries restantesl cultures afin de parvenir à une concentration finale de 10% de DMSO et conserver à -80 ° C. Évaluer la dilution optimale de la façon suivante: faire en sorte que les colonies sont de 0,5 à 1 mm de diamètre et sont convenablement isolées pour éviter la contamination croisée. Décongeler restant cultures bactériennes à partir du point 1.4.2 et la plaque à la dilution appropriée sur ACCM-2 agar comme décrit dans 1.4.1.2 et 1.4.1.3. Incuber pendant 6 à 7 jours comme décrit dans 1.4.1.3.5. Une fois que les colonies sont détectables, les recueillir en coupant l'extrémité d'une pointe de 1 ml, la cueillette de la fiche contenant des colonies isolées et la dispersion de la colonie par pipetage dans 1,5 ml d'ACCM-2 contenant les antibiotiques appropriés (375 pg / ml de kanamycine ou 3 pg / ml de chloramphénicol) dans une plaque de 24 puits. Amplifier colonies individuelles pendant 6 jours dans les conditions décrites au paragraphe 1.3.1. Au jour 3 de l'incubation, disperser les amas bactériens par pipetage chaque culture. Stocker chaque suspension mutant dans 2D tubes BOUCHON code à barres dans des plaques à 96 puits dans 10% De DMSO à -80 ° C. L'évaluation de la concentration bactérienne: Remarque: le protocole suivant peut être appliqué pour obtenir les courbes des mutants à replication bactériennes dans un milieu axénique (voir 1.4.4) de croissance. Norme préparation de la courbe: Préparer un / stock ml solution à 2 pg d'ADN double brin (typiquement un plasmide aléatoire de taille connue et la concentration) en 1x Tris-EDTA (TE). Préparer 10 dilutions successives de la solution mère pour obtenir des concentrations allant de 2 pg / ml à 2 ng / ml. Distribuer 50 pi de chaque concentration de puits individuels d'une microplaque de 96 puits avec des murs noirs et le fond (voir le tableau des matériaux). On dilue le réactif quantification ADNdb 1: 200 dans du tampon 1 x TE et ajouter 55 ul du réactif dilué dans chaque échantillon dans la microplaque à 96 puits. Mélangez bien à l'aide d'un agitateur de plaque et incuber pendant 2 à 5 min à température ambiante, dans l'obscurité. Mesurer la fluorescence des échantillons en utilisant une fluorescence unence lecteur et filtres microplaque pour des longueurs d'onde standards de fluorescéine (~ excitation 480 nm, émission ~ 520 nm). Tracer la gamme de concentration de plasmide contre les lectures d'intensité de fluorescence. Suspension bactérienne quantification: Distribuer 5 pi de 10% de Triton X-100 par puits dans une microplaque de 96 puits avec des murs noirs et le fond (voir le tableau des matériaux). Ajouter 50 pi des suspensions bactériennes dans chaque puits et incuber 10 min à température ambiante, sur un agitateur de plaque. On dilue le réactif quantification ADNdb 1: 200 dans du tampon 1 x TE et ajouter 55 ul du réactif dilué dans chaque échantillon dans la microplaque à 96 puits. Mélangez bien à l'aide d'un agitateur de plaque et incuber pendant 2 à 5 min à température ambiante, dans l'obscurité. Mesurer la fluorescence des échantillons en utilisant un lecteur et des filtres de fluorescence pour microplaques longueurs d'onde standards de fluorescéine (~ excitation 480 nm, émission ~ 520 nm). Pour obtenir le DN bactérienneUne concentration, tracer les lectures de fluorescence dans le tableau obtenu au point 1.5.1.4. Diviser la concentration d'ADN par la masse du génome de Coxiella (2,2 fg) pour obtenir des concentrations bactériennes. Exprimez résultats de génome / ml équivalentes. Jeter les mutants présentant un défaut de croissance significative dans ACCM-2. 2. Primer seule colonie PCR, séquençage et d'annotation Remarque: le protocole suivant est pour l'amplification d'ADN de 96 échantillons, une pipette multicanaux est recommandé pour les étapes suivantes. purification de la colonne de produits de PCR utilisant des billes magnétiques et séquençage de l'ADN avec une amorce spécifique-transposon (2.3) sont sous-traitée à une société externe. Assurez-vous que l'amorce d'amplification est conçue pour hybrider entre 100 et 200 paires de bases en amont de l'unité de répétition en tandem inverse (ITR), pour obtenir des produits de PCR couvrant le site d'insertion du transposon sur Coxiellun génome. Préparer 3 ml de mélange de PCR (1x tampon de haute fidélité, 200 uM de dNTP, 1 uM amorce d'amplification, 20 U / ml de haute fidélité de l'ADN polymérase) et distribuer 29 pi par puits dans une plaque à 96 puits PCR mis sur la glace. Transfer 1 ul de chaque mutant en phase stationnaire dans ACCM-2 au mélange de PCR. Exécuter PCR avec une dénaturation initiale (98 ° C, 1 min), 20 cycles de haute stringence (98 ° C, 10 s; 50 ° C, 30 s; 72 ° C, 90 sec), 30 cycles de faible stringence (98 ° C, 10 sec; 30 ° C, 30 s; 72 ° C, 90 sec) et 30 cycles de stringence élevée (98 ° C, 10 s; 50 ° C, 30 s; 72 ° C, 90 sec) suivi d'une extension finale à 72 ° C pendant 7 min. Purifier produits de PCR utilisant des billes magnétiques et de l'ADN de séquence avec une amorce spécifique transposon. Concevoir l'amorce spécifique de transposon avec une température de fusion comprise entre prédite 50 ° C et 75 ° C, une teneur en GC comprise entre 40% et 60%, une longueur comprise entre 18 et 25 nucléotides et si un de recuitte en aval du site d'hybridation d'amorce et l'amplification d'au moins 100 paires de bases en amont de la première paire de l'ITR du transposon de base. Grâce à un logiciel d'analyse de séquence, charger le complète, génome annoté de Coxiella burnetii 493 NMI. Utilisez la fonction "aligner à la référence" pour charger et aligner (blastn) les résultats de séquençage et de déterminer le site de la transposition. Jeter mutants avec des non-appariement et / ou l'affichage à double reads.To surveiller la saturation de la bibliothèque mutant, garder une trace de la présence de multiples insertions de transposons sur le même site. 3. Les cellules eucaryotes défi avec Coxiella Mutants et la surveillance des intracellulaire croissance Remarque: Une pipette multicanaux est recommandée pour les étapes suivantes. Les infections ont été effectuées en triple dans stérile microplaques de 96 puits avec des murs noirs et fond transparent plat. Coxiella burnetii poids exprimant la GFP 14 wtel que prévu par le Dr Robert Heinzen. Cultiver des cellules Vero dans du RPMI sans rouge de phénol supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) en l'absence d'antibiotiques (RPMI complet médias). Le jour avant l'infection, se laver les cellules Vero confluentes à partir d'un sous-confluente ou ballon de culture de cellules avec 10 ml de PBS. Détacher les cellules Vero en ajoutant 1 ml de solution de trypsine EDTA dans le ballon de culture de cellules et incuber pendant 3 à 5 min à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. Resuspendre les cellules dans 10 ml de milieu RPMI complet. Compter les cellules et à préparer une suspension cellulaire de 10 5 cellules par ml. Distribuer 100 ul de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de 96 puits noir avec fond transparent plat. Centrifuger pendant 5 minutes à 400 x g à la température ambiante pour faciliter l'adhérence des cellules au fond des puits et incuber pendant une nuit à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. Décongeler les plaques à 96 puits contenant du Comutants xiella à RT et diluer 150 pi de suspension bactérienne dans 300 pi de RPMI sans rouge de phénol et de FBS dans un puits profond plaque de 96 puits. Retirez le papier de la microplaque contenant des cellules Vero et distribuer 100 pl / puits de mutants Coxiella dilué (MOI de 100). Utilisez le puits A1 comme négatif (cellules non infectées) A2 de contrôle et de puits et A3 comme contrôles positifs (cellules infectées par Coxiella poids exprimant la GFP 14 à des multiplicités d'infections (MOI) de 100 et 200). Centrifuger la plaque pendant 10 min à 400 g à température ambiante en utilisant un support de plaque d'centrifugeuse étanche aux aérosols. Incuber à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 pendant 2 heures puis remettez-les bactéries contenant le milieu avec 100 pl / puits de, milieu frais RPMI complet. Mesurer la fluorescence de la GFP tous les jours pendant 7 jours en utilisant un lecteur et des filtres de fluorescence pour microplaques longueurs d'onde standards de fluorescéine (~ excitation 480 nm, émission ~ 520 nm). Éviterperturbations dues à la condensation et à la dispersion du signal dans le milieu de culture, en utilisant une excitation de fond et enregistrement de l'émission sur le lecteur de microplaques. 4. Préparation des échantillons pour l'acquisition d'images automatisé Remarque: La procédure est pour une plaque de 96 puits, l'échelle des volumes en conséquence. Étapes de 4.2 peuvent profiter d'un laveur de plaques. Le 7 après l'infection d'une journée, éliminer le milieu de la plaque et les remplacer par 50 pl / puits de milieu complet frais contenant un colorant fluorescent perméable cellulaire à la dilution appropriée (habituellement de 1: 1000, doit être optimisé en fonction de la lignée cellulaire utilisée ). Incuber les cellules pendant 30 – 60 min à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. Remplacer milieu avec 50 pl / puits de 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS, incuber pendant 30 min à température ambiante (TA) puis retirer le tampon contenant du PFA et laver 3 fois avec du PBS. Retirer du PBS et Dispense 50 pl / puits de solution de blocage (0,5% d'albumine de sérum bovin, 50 mM de NH 4 Cl dans du PBS, pH 7,4) additionné de 0,05% de saponine. Incuber à température ambiante pendant 30 min. Remplacer solution de blocage avec 40 pl / puits de solution de blocage frais supplémenté avec de la saponine (comme ci-dessus) et avec un anticorps anti-LAMP1 à une dilution de 1: 500. Incuber la plaque pendant 30 min à température ambiante. Retirer la solution de blocage et laver la plaque de 96 puits 5 fois avec 100 pl / puits de PBS. Distribuer 40 pl / puits de solution de blocage additionné de saponine (comme ci-dessus), l'anticorps secondaire marqué par fluorescence approprié (à une dilution de 1: 1000) pour révéler l'anticorps anti-LAMP1 appliqué à l'étape 4.4, et avec Hoechst 33258 à 5 pg / ml. Incuber la plaque pendant 30 min à température ambiante. Retirer la solution de blocage et laver la plaque de 96 puits 5 fois avec 100 pl / puits de PBS. Laissez le volume de PBS correspondant au dernier lavage dans la plaque de 96 puits, que les cellules fixées ne doivent pas sécher. L'image de la plaque immédiatement ou plaque de conserver à 4 ° C, à l'abri de la lumière, pour une analyse ultérieure. 5. Image Acquisition Acquérir des images de la GFP (488 nm, bactéries), Hoechst 33258 (350 nm, la cellule hôte de noyaux), rouge (~ 555 nm, la membrane cellulaire de marqueur) et rouge lointain (~ 615 nm, LAMP1) canaux en utilisant une épifluorescence automatisé microscope équipé avec un objectif 20X. Acquérir 21 champs indépendants par puits pour l'image d'un minimum de 5 000 cellules par échantillon. Appliquer autofocus en utilisant le canal noyaux de la cellule hôte comme une référence. Lorsque vous travaillez avec des bactéries pathogènes infectant un faible pourcentage de cellules hôtes, les utilisateurs peuvent ajuster le nombre de champs indépendants imagées par puits, afin d'obtenir un minimum de 500 cellules infectées à analyser. 6. Traitement de l'image Note: les étapes suivantes sont spécifiques pour l'utilisation de la CellProfiler logiciel d'analyse d'image. Dans tous les cas, la algorit optimalehm pour la segmentation doit être définie expérimentalement et les objets touchant la frontière de l'image doit être éliminée avec la fonction appropriée. Charger toutes les images dans CellProfiler. Utilisez le module "ImageMath" pour soustraire le canal de GFP du canal Hoechst, pour éviter la détection de colonies Coxiella (également marquées par Hoechst) que les noyaux des cellules de l'hôte dans les étapes suivantes. Utilisez le module "IdentifyPrimaryObjects" à noyaux cellulaires secteur d'accueil de l'image résultant de l'étape 6.2. Nommez les objets segmentés «noyaux». Utilisez le module "IdentifySecondaryObjects" à cellules segments d'accueil de 555 nm en utilisant les images des noyaux détectées à l'étape 6.3 comme semences. Nommez les objets segmentés «Cellules». (Facultatif) Utilisez le module "IdentifyTertiaryObjects" pour soustraire noyaux identifiés à l'étape 6.3 de cellules identifiées à l'étape 6.4. Nommez les objets segmentés cytoplasme "221 ;. Utilisez le module "EnhanceOrSuppressFeatures" sur les 615 images nm pour éliminer fond et de faciliter l'identification suivante de compartiments de LAMPE1 positif. Utilisez le module "IdentifyPrimaryObjects" sur l'image obtenue à l'étape 6.6 pour identifier les compartiments de LAMPE1 positif. Nommez les objets segmentés "lysosomes". Utilisez le module "IdentifyPrimaryObjects» sur l'image à 488 nm à identifier les colonies Coxiella. Nommez les objets segmentés "colonies". Utilisez le module "IdentifySecondaryObjects" sur les 615 images nm pour identifier les vacuoles contenant Coxiella-en utilisant les colonies Coxiella détectés à l'étape 6.8 comme semences. Nommez les objets segmentés "de CCVS". Utilisez le module "MaskObjects" pour sélectionner CCVs détectés sur des cellules (comme les cellules touchant la frontière de l'image ont été éliminés, certains CCV peuvent être détectés cellules "extérieurs"). Nommez les resObjets Ulting "CCVs filtrées". Utilisez le module "MaskObjects" pour sélectionner colonies détectées sur des cellules (comme les cellules touchant la frontière de l'image ont été éliminés, certaines colonies peuvent être détectés cellules "extérieurs"). Nommez les objets qui en résultent "des Colonies filtrées". Utilisez le module "MaskObjects" d'associer lysosomes de cellules. Nommez les objets qui en résultent "filtrée Lysosomes". Utilisez le module "MaskObjects" pour sélectionner des cellules contenant des colonies Coxiella. Nommez les objets résultant de "cellules infectées". Utilisez le module "Relier les objets" pour définir les objets "de CCVS filtrées" que les enfants des objets parents "Cellules". Cela permettra à compter le nombre de VCC / Cell. Utilisez le module "Relier les objets" pour définir les objets "des Colonies filtrées" que les enfants des objets parents "Cellules". Cette volontépermettre le comptage du nombre de colonies / Cell. Utilisez le module "Relier les objets" pour définir les objets "filtrée Lysosomes" comme les enfants des objets parents «Cellules». Cela permettra à compter le nombre de lysosomes / Cell. Utilisez le module "MeasureObjectSizeShape" pour obtenir une analyse morphologique des noyaux, les cellules, CCVS filtré, Colonies filtrée et filtrée lysosomes Utilisez le module "MeasureObjectIntensity" pour quantifier la fluorescence de la GFP associé à Filtrée CCV et d'estimer l'efficacité de la réplication au sein de Coxiella CCV. En utilisant les modules "OverlayOutlines" et "SaveImages" superposer les résultats de segmentation et l'image d'origine pour le contrôle de la qualité. Utilisez le module "ExportToSpreadsheet" d'exporter la totalité ou une sélection de résultats d'analyse d'image. (Facultatif) Utilisez le module "ExportToDatabase" pour analyser les résultatsl'aide de l'analyste de CellProfiler logiciel. 7. Analyse des données Pour chaque paramètre obtenu, identifier et éliminer les valeurs aberrantes (en raison d'erreurs dans la segmentation d'image), puis calculer les valeurs moyennes par mutant. Utilisez Z-scores pour identifier les phénotypes importantes. Considérez phénotypes avec un Z-score> -2 comme non significative, les phénotypes avec un Z-score entre -2 et -4 aussi doux et phénotypes avec un Z-score ≤ -4 aussi forte. combinaisons de terrain de paramètres en fonction des besoins expérimentaux.