جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em> الكوكسيلا البورنيتية</em> المسوخ ينقول
Summary
الكوكسيلا البورنيتية هو سلبية الغرام بين الخلايا بكتيريا تلزم مسؤولة عن حمى المرض Q الحيوانية. نحن هنا وصف الطرق لتوليد الكوكسيلا المسوخ ينقول الفلورسنت وكذلك تحديد الآلية وتحليل الناتج الداخلي، والنسخ والسامة للخلايا الظواهر.
Abstract
غزو واستعمار الخلايا المضيفة التي كتبها مسببات الأمراض البكتيرية تعتمد على نشاط عدد كبير من البروتينات بدائية النواة، الذي يعرف بأنه عوامل الفوعة، والتي يمكن تخريب والتلاعب وظائف المضيفة الرئيسية. دراسة التفاعلات المضيف / الممرض ولذا فإن من المهم جدا فهم الالتهابات البكتيرية ووضع استراتيجيات بديلة لمواجهة الأمراض المعدية. هذا النهج ومع ذلك، يتطلب تطوير فحوصات عالية الإنتاجية الجديدة للمتحيز، وتحديد الآلية وتوصيف محددات الفوعة البكتيرية. هنا، نحن تصف طريقة لتوليد مكتبة متحولة الموسومة GFP التي كتبها ينقول الطفرات وتطوير فحص عالية المحتوى نهج لتحديد وقت واحد من عدة الظواهر المرتبطة ينقول. لدينا نموذج عمل هو داخل الخلايا البكتيرية البورنيتية الممرض الكوكسيلا، العامل المسبب للمرض من هذه الأمراض حمى Q، الذي يرتبط مع ذاتهاتفشي فير مع ما يترتب على صحة والعبء الاقتصادي. طبيعة الخلايا تلزم هذه العوامل المسببة للأمراض وحتى وقت قريب، أعاقت بشدة تحديد العوامل البكتيرية تشارك في التفاعلات الممرض المضيف، مما يجعل من الكوكسيلا النموذج المثالي لتنفيذ النهج عالية الإنتاجية / عالية المحتوى.
Introduction
والناشئة، والبكتيريا المتوطنة الكوكسيلا البورنيتية هو المسؤول عن تفشي كبيرة من حمى Q، موهنة شبيهة بأعراض الانفلونزا حيواني المنشأ مع صحية حادة والأثر الاقتصادي 1. الخزانات الرئيسية للالكوكسيلا هي الحيوانات المنزلية والزراعية، وتشير التقديرات إلى أن أكثر من 90٪ من الأبقار الحلوب في الولايات المتحدة تحمل C. البورنيتية 2. البشر هم المضيفين من قبيل الصدفة ان يصاب عن طريق الاستنشاق من الهباء الجوي الملوث. يظهر حمى Q الإنسان إما مرض حاد أو مزمن، والتي قد يكون لها مضاعفات مميتة مع معدل وفيات تصل إلى 65٪ 1،3. مع جرعة المعدية من 1-10 الكائنات الحية، الكوكسيلا هي العوامل المسببة للأمراض المعدية الأكثر المعروفة وكانت قد أجرت التحقيق أنها المحتملين الحيوي سلاح 4. اندلاع ناسفة في الآونة الأخيرة حمى Q في هولندا (2007 – 2010)، مع الحالات تتصاعد من 182 إلى أكثر من 2000 في السنة، وتقف كمثال على الفوعة الشديدة من هذا الممرض5.
كفاءة ملحوظة من التهابات الكوكسيلا المرجح يرتبط مع مقاومته للإجهاد البيئي، جنبا إلى جنب مع التكيف الفريد للخلايا المضيفة. في الواقع، الكوكسيلا موجود في البيئة في شكل غير نشطة عملية الأيض المتغيرات زنزانة صغيرة (SCV)، والتي هي مقاومة ملحوظة لعدة ظروف قاسية (جفاف، ودرجة الحرارة، وغيرها). تؤخذ SCVs من قبل الخلايا البلعمية عبر α V β 3 integrins 6 في حين يتم بوساطة غزو الخلايا غير البلعمية من قبل الكوكسيلا التصاق / الغزو OmpA 7 ومستقبلات بعد مجهولين. بعد امتصاص، الكوكسيلا يقيم في فجوات ضيقة، سواء كان إيجابيا للعلامات endosomal مبكرة Rab5 وEEA1 8. البكتيريا تستجيب للendosomal تحمض عن طريق تحويل إلى المتغيرات زنزانة كبيرة عملية الأيض نشطة (LCVs) وتفعيل نقطة / آي سي إم نوع 4 نظام إفراز (T4SS) 9، مثلي للغاية لأنه من البكتيريا المستروحة 10. إفراز مؤثرات نقطة / آي سي إم تسمح الكوكسيلا لتوليد كبيرة،-LAMP1 إيجابي مقصورة الحمضية التي تحتوي على الانزيمات الليزوزومية نشطة حيث يمكن للبكتيريا تزدهر والعمل بنشاط على حماية الخلايا المصابة من موت الخلايا المبرمج 11. وبالتالي، يتم التحكم في دورة الخلايا من الكوكسيلا من قبل النبات نقطة / آي سي إم بوساطة من المستجيبات البكتيرية 12، ومع ذلك، فإن العوامل الميكروبية المشاركة في غزو الخلية المضيفة، والنسخ البكتيرية ونشر العدوى لا تزال مجهولة إلى حد كبير.
الجمع بين الطفرات ينقول والمقايسات القائم على مضان، نحن نعمل على تطوير المناهج مشاركات لتحديد وقت واحد من العوامل البكتيرية المشتركة في الخطوات الرئيسية لالتهابات الكوكسيلا: 1) استيعاب داخل الخلايا المضيفة، 2) تكرار داخل الخلايا، 3) انتشار الخلية الى خلية و4) استمرار. حتى الآن، لدينا فحص ما يزيد على 1000 مترutations في 500 تسلسل الكوكسيلا الترميز، والتي وفرت لنا رؤى غير مسبوقة في التفاعلات المضيف الممرض التي تنظم الكوكسيلا المرضية 7. من المذكرة، فإن هذا النهج يمكن تطبيقها على دراسة مسببات الأمراض بين الخلايا الأخرى التي تشترك في السمات بيولوجيا الخلية مع الكوكسيلا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أثبتت دراسة التفاعلات المضيف / الممرض أن تكون طريقة رائعة لفهم الالتهابات البكتيرية ووضع استراتيجيات بديلة لمواجهة الأمراض المعدية. ولكن نظرا لتنوع الاستراتيجيات التي وضعتها مسببات الأمراض البكتيرية المختلفة، وتحديد وتوصيف عوامل الفوعة البكتيرية وللمضيف مسارات الإشارات التي تستهدف خلال العدوى تمثل تحديا حقيقيا. هذا يدعو إلى تطوير أساليب جديدة لتحديد نطاق واسع من المحاور الرئيسية تفاعل المضيف / الممرض. التطورات الأخيرة في المبتكرة، عالية الإنتاجية وتقنيات فحص عالية المحتوى تمثل مصدرا قيما التي يمكن تكييفها لدراسة مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا 15. هنا، وقد استخدمنا الحيوانية البكتيرية الممرضة الكوكسيلا البورنيتية كنموذج لوضع نهج الفحص التي تجمع بين الطفرات ينقول والمقايسات القائم على مضان. الاهميهTLY، وهذا الأسلوب يسمح فحص رصد في وقت واحد من خطوات متعددة من دورة الخلايا الكوكسيلا، وتوفير نظرة شاملة للاستراتيجيات التي وضعتها هذه البكتيريا لغزو وتكرارها وتستمر داخل الخلايا المصابة.
ويستند هذا النهج المبين هنا على اثنين من تقنيات راسخة، الطفرات ينقول والمقايسات القائم على مضان، والتي تم تطبيقها بنجاح في دراسة مسببات الأمراض البكتيرية. الجمع بين هذه التقنيات في سياق شاشات عالية الإنتاجية / عالية المحتوى يسمح لنا لتقييم الآثار المترتبة على عدد كبير من الطفرات البكتيرية عن طريق تحليل عدد كبير جدا من الأحداث (عادة 15000 الخلايا المصابة في الطفرات البكتيرية يتم تصويرها وتحليلها). وهذا يوفر تحليلا إحصائيا مهما من أحداث مثل الغزو الجرثومي للخلايا المضيفة وتكرار داخل الخلايا، والتي هي، بطبيعتها، تخضع لتقلبات عالية. من المهم أن نلاحظ أن خطوط الخلايا الأخرى من الجيش الشعبيithelial يمكن استخدامها لهذا النوع من الفحص. ومع ذلك، الخلايا الظهارية مسطحة وكبيرة هي الأمثل لتحليل الصور كما عضيات الخلية المضيفة هي أسهل للكشف. لأن الغالبية العظمى من المجاهر الآلي يمكن التعامل تلقائيا عدد كبير من لوحات، وتكاد لا توجد أية حدود لعدد من المسوخ التي يمكن فرزهم في وقت واحد. اعتمادا على العوامل المسببة للأمراض، يمكن للمستخدم امتياز استخدام وسيلة epifluorescence أو المجهر متحد البؤر. ووقت الحصول على الصور تعتمد في الغالب على حساسية الكاميرا المجهر، على عدد من المجالات المكتسبة لكل بئر وعلى عدد من القنوات المكتسبة في مجال الرؤية. يمكن للمستخدم أن تقرر كيفية ضبط هذه العوامل لتحسين بروتوكول الفرز. وكمثال على ذلك، ونحن تصوير واحدة 96-جيدا لوحة / ساعة باستخدام الظروف المشار إليها في النقطة 5.1. تحليل الصور يعتمد إلى حد كبير على الجهاز (أو مجموعة من الآلات) المستخدمة. نستخدم النواة 12 (2 × 3.06 جيجاهرتز 6 النواة)، 48 GB RAM محطة العمل. هذا الجهاز يتطلب يقاربالمطاف 40 دقيقة لتحليل الصور تم الحصول عليها من لوحة واحدة.
أحد الجوانب الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار عند وضع هذه المقايسات هو مجموعة تتكون من جديد (أو الاستفادة المثلى من القائمة) بروتوكولات للسماح للتلاعب وتجهيز عدد كبير من العينات. والمثال النموذجي هو تطوير مستعمرة التمهيدي PCR نهج واحد، الأمر الذي سمح لنا لتضخيم بسرعة وشظايا تسلسل الكوكسيلا DNA يحتوي على موقع الإدراج كل ينقول، من عينات صغيرة جدا. بناء على خبرتنا، والبلمرة عالية الدقة لابد من اختيارها بعناية واختبارها من أجل الحصول على نتائج يمكن استنساخه. والقيد الوحيد من هذا النهج قد يخفي في مراقبة ذلك، في معظم الحالات، حوالي 30٪ من العينات المصنعة ليست عرضة للاستغلال، إما بسبب PCR أو الخطوات التسلسل. ومع ذلك، معتبرا أن عزل الجديدة المسوخ ينقول الكوكسيلا ليس الحد من معدل خطوة، وهذا لا ممثلى أعضاءأرسلت قضية رئيسية. وبالمثل، فإن تطوير مقايسة موثوقة لقياس تركيز البكتيريا الأسهم متحولة الرئيسي لهذا النهج. نظرا لميل الكوكسيلا لتجميع عندما تكون في تعليق، واستخدام قراءات الكثافة الضوئية لا ينطبق على حساب تركيز الثقافات الكوكسيلا والبديل موجود الوحيد كان الكمي PCR (QPCR). هنا، استخدام DNA وكيل الإقحام الموسومة fluorescently تسريع بشكل ملحوظ البكتيريا الكميات.
وهذا النهج يمكن أيضا الاستفادة من استخدام خطوط الخلايا مستقرة التعبير عن علامات الفلورسنت لعدة حجرات داخل الخلايا اعتمادا على العوامل المسببة للأمراض المستخدمة. جانب مهم آخر هو استخدام وسائل الإعلام ثقافة الخلية خالية من الفينول الأحمر. لاحظنا أن هذا مؤشر الرقم الهيدروجيني له مضان الطبيعي الذي يمتد الطيف الأحمر والأخضر الذي يشبع الإشارات المسجلة على القارئ مضان الآلي.
تيانه الاستراتيجية المقدمة هنا تعتمد على العشوائية ينقول الطفرات. لطفرات من الفائدة، نوصي التحقق من صحة التبديلات فريدة من نوعها (وقابلية التنسيل) باستخدام صمة عار الجنوبية والتكبير PCR للموقع ينقول الإدراج.
إلى جانب معدات الموضحة في قسم البروتوكول، فرق الراغبة في استخدام نهج فحص المعروضة هنا، سوف تأخذ ميزة كبيرة في مجموعة تتكون من قاعدة بيانات علائقية لجمع البيانات، الخادم لتخزين البيانات ومحطة عمل لتحليل الصور السريع.
الأهم من ذلك، وفرت طريقة الموصوفة هنا هي مناسبة لدراسة مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا الأخرى وجود أسلوب الطفرات العشوائية لمسببات المرض، خطوط الخلايا يمكن أن يصاب من قبل الممرض وهذا واحد يعرض النمط الظاهري محددة خلال العدوى.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N° 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.
Materials
| Citric acid | Sigma | C0759-500G | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641-500G | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218-100G | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670-100G | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080-500G | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Sigma | F8633-250G | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625-500G | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852-25G | ACCM-2 medium component |
| Bacto Neopeptone | BD (Beckton-Dickinson) | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | BD (Beckton-Dickinson) | 223050 | ACCM-2 medium component |
| Methyl-B-Cyclodextrin | Sigma | C4555-10G | ACCM-2 medium component |
| RPMI w/glutamax | Gibco | 61870-010 | ACCM-2 medium component |
| RPMI w/glutamax, without phenol red | Gibco | 32404-014 | For cell culture and infection |
| Fetal Bovine Serum | GE healthcare | SH30071 | For cell culture |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | For cell culture |
| Saponin | Sigma | 47036 | For immunofluorescence staining |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | For immunofluorescence staining |
| Bovine Serum Albumine | Sigma | A2153 | For immunofluorescence staining |
| Electroporation cuvette 0.1 cm | Eurogentec | ce0001-50 | For Coxiella transformation |
| Trackmates screw top tubes with caps | Thermo Scientific | 3741 | 2D barcoded screwcap |
| 96-well microplate with black walls and bottom | Greiner | 655076 | Flat dark bottom, for dsDNA quantitation |
| 96-well microplate, ��clear, black walls | Greiner | 655090 | Flat transparent bottom, for cell culture and imaging |
| 96-well PCR microplate | Biorad | 2239441 | DNAse/RNAse free |
| 96-well plate, Deepwell | Labcon | 949481 | For Coxiella mutants infections |
| PicoGreen | Life Technologies | P7581 | For dsDNA quantitation |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | For dsDNA quantitation |
| Phusion High fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | For single primer colony PCR |
| Celltracker Red CMTPX | Life Technologies | C34552 | For imaging |
| Anti-LAMP1 antibody | Sigma | 94403-1ML | For immunofluorescence staining |
| Hoechst 33258 | Sigma | L1418 | For imaging |
| Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro | Tecan | ||
| Epifluorescence automated microscope Cellomics | Thermo Scientific |
Referenzen
- Maurin, M., Raoult, D. Q fever. Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).
- Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States. Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).
- Kazar, J. Coxiella burnetii. infection. Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).
- Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).
- Der Hoek, W. V. a. n., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).
- Capo, C., et al. Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3. Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).
- Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Berón, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell. Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole. PloS one. 8 (1), e54566 (2013).
- Vogel, J. P. Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii.. Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).
- Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii. Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).
- Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. mBio. 2, (2011).
- Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium. Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).
- Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).
- Brodin, P., Christophe, T. High-content screening in infectious diseases. Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).
