Summary

Генерация рекомбинантного человеческого IgG моноклональных антител из иммортализованных клеток Сортировка В

Published: June 05, 2015
doi:

Summary

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Abstract

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Introduction

Цель этой статьи заключается в описании подробно методику для создания и описания человека IgG моноклональные антитела, полученные из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).

Интерес к изучению человеческих антител вырос в различных областях исследований. В частности, многие исследовательские группы заинтересованы в патологии, вызванной аутоантител 1-3. Мы клонированы и охарактеризованы патогенные аутоантитела 1. Исследование аутоантител может помочь определить свои цели и разработать терапевтические стратегии, например, с использованием антител конкурентов 4. Кроме того, изучение человеческих антител также может представлять интерес в других областях научных исследований, т.е. оценить иммунный ответ после вакцинации 5, чтобы охарактеризовать профиль антител лиц, которые подвергались и стали устойчивыми к определенным возбудителей 6 или исследование, которое антитела вестественно репертуар 7,12.

Некоторые методы были разработаны для создания рекомбинантных человеческих моноклональных антител 8-12; большинство из них используют фага дисплей и В-клеток увековечение. Использование фагах широко применяется для открытия новых антител 13. Однако она имеет существенный недостаток, а именно, что тяжелой и легкой цепи пары иммуноглобулина человека стать диссоциируют в процессе. Производство гибридом с клетками человека или трансформации В EBV преодолевает этот недостаток.

Мы используем инфекции тимуса В-клеток с EBV в сочетании со стимуляцией поликлональные B клеток с помощью Toll-подобных рецепторов (TLR 9-9) 6,12.

В этой статье мы подробно описать технологию, которую мы используем для развития IgG антител человека, с полным обзором всех шагах от изоляции РВМС в пробирке поколения антител в в. Этопротокол может быть использован для анализа любого типа профиля человеческого IgG. В нашей лаборатории, В-клетки, продуцирующие IgG антитела были успешно отделен от остальной части РВМС после сортировки. Пятьдесят упорядоченные B клетки 8, то можно покрыть в несколько луночных планшетах и увековечен ВЭБ и TLR-9 активации для клональной экспансии отдельных клеток В. В питающих клеток, фибробласты из ткани эмбриональных легких человека были использованы, клеточной линии WI38, что облегчает визуализацию иммортализованных В-клеток. Из этих В-клеток, последовательности тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина могут быть получены с помощью ПЦР, и гены антител клонируют в "иммуноглобулина G векторов экспрессии и производится в пробирке. Используя эту технику, одиночные антитела с точно таким же антитела последовательности, найденной в донора могут быть изучены.

Protocol

Информированное согласие было получено от участников исследования. Исследование было одобрено комитетом по этике институциональной. 1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) Центрифуга 25 мл гепаринизированной крови участников на 900 мкг в те?…

Representative Results

Сортировка стробирования после окрашивания CD22 и IgG-положительных клеток показано на рисунке 1 На этом изображении площадь двойных позитивных клеток -. B клетки, продуцирующие антитела IgG – выбирается сортировать все эти клетки в отдельную пробирку. При анализе, примерно 1% от общ…

Discussion

В этой рукописи, все шаги для генерации антител IgG от человека МНПК представлены в деталях. Этот протокол включает в себя несколько преимуществ по сравнению с ранее опубликованными методиками. Одним из преимуществ является то, что антитела, полученные держит тяжелые и легкие цепи, соот?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследования контракт Мигель Сервет (ISCIII CD14 / 00032), чтобы (GN-G.). Братство от Нидерландской организации научных исследований "Высшей школы трансляционной неврологии программе" (022005019) в (CH).

Субсидии из Принцев Беатрикс Fonds (проект WAR08-12) и Ассоциации Франсез контр ле Миопатии в (ЛС-М.); а также в Вени Братства Нидерландской организации научных исследований (916.10.148) в общении мозга Фонда Нидерландов (FS2008 (1) -28) и Prinses Беатрикс Fonds (Проект WAR08-12) (ОД ).

Мы благодарим Jozien Ясперс за помощь в B-клетки сортировки с помощью проточной цитометрии.

Materials

Histopaque-1077  Sigma-Aldrich 10771 solution containing polysucrose and sodium diatrizoate
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 
96 U-bottom micro well plates  Costar 3799
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium  Gibco, Life Technologies 12633-020
30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line   ATCC CRL-1612 3.4 x 108 copies/ml
CpG2006  Invivogen ODN 7909
Wi38 cells  Sigma-Aldrich 90020107
Interleukin-2 Roche  10799068001
ELISA plates Greiner Bio-One, Microlon 655092
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) Jackson ImmunoResearch 109-006-008
4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker)  Biorad 170-6404
Human IgG  Sigma I 2511 HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml
Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) Jackson ImmunoResearch 109-036-008
ELISA reader (Perkin Elmer 2030)  Perkin Elmer  2030-0050
Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ  Jackson ImmunoResearch 309-035-095
SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System  Invitrogen  18080-200
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 Applied Biosystems
High Pure RNA Isolation Kit  Roche 11828665001
Reverse transcription system kit  Promega A3500
Recombinant Taq DNA Polymerase TAKARA R001A
Primers (2μl) Sigma
Ultrapure Agarose  Invitrogen 16500-500
100 bp ladder Invitrogen 15628-019
Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) Biorad 170-8100
QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28106
BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit  Applied Biosystems 4337455
0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) Applied Biosystems 4346906
Genetic analyser ABI300  Applied Biosystems 4346906
DH5α competent cells (E. coli) Invitrogen 18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp) Invivogen pfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp)  Invivogen pfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp) Invivogen pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp)  Invivogen pfuse2ss-hcll2
SOC medium Invitrogen 15544-034
LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) Invivogen fas-zn-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) Invivogen fas-zn-l
DNA Miniprep kit  Omega Bio Technology D6942-02
Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) Nanodrop
LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) Invivogen fas-bl-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) Invivogen fas-bl-l
EcoRI New England Biolabs R0101S 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI
NheI New England Biolabs R0131S 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA ladder New England Biolabs N3200S 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml
XmaI New England Biolabs R0180S 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
BsiWI New England Biolabs R0553S 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1
AvrII New England Biolabs R0174S 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 1 U/µL, in 10x FastAP Buffer
DH5α competent cells  Invitrogen 18263-012
PE Mouse Anti-Human IgG BD Pharmingen 555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 Fisher scientific BDB563942
QIAprep Spin Miniprep Kit  QIAGEN 27106
BigDye Terminator v3.1 Applied Biosystems 4337455

Referenzen

  1. Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
  2. Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
  3. Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
  4. Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
  5. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  6. Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
  7. Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
  8. Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
  9. Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
  10. Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
  11. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  12. Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
  13. Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
  14. Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan … [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
  15. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
  16. Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
  17. Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321 (2011).
  18. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Nogales-Gadea, G., Saxena, A., Hoffmann, C., Hounjet, J., Coenen, D., Molenaar, P., Losen, M., Martinez-Martinez, P. Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells. J. Vis. Exp. (100), e52830, doi:10.3791/52830 (2015).

View Video