Summary

Génération de Recombinant Human IgG anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées Classé B

Published: June 05, 2015
doi:

Summary

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Abstract

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Introduction

Le but de cet article est de décrire en détail une méthodologie pour générer et caractériser des anticorps monoclonaux IgG humaines obtenues à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP) humaines.

L'intérêt d'étudier des anticorps humains a augmenté dans de nombreux domaines de recherche. En particulier, de nombreux groupes de recherche sont intéressés à la pathologie causée par des auto-anticorps 1-3. Nous avons cloné et caractérisé pathogènes auto-anticorps 1. L'étude d'auto-anticorps peut aider à identifier leurs objectifs et d'élaborer des stratégies thérapeutiques, par exemple, en utilisant des anticorps concurrents 4. En outre, l'étude d'anticorps humains peut aussi être d'intérêt dans d'autres domaines de la recherche, à savoir, pour évaluer la réponse immunitaire après la vaccination 5, pour caractériser le profil d'anticorps d'individus qui ont été exposés et qui sont devenus résistants aux pathogènes spécifiques 6 ou pour étudier ce qui anticorps sont enle répertoire naturel 7,12.

Plusieurs techniques ont été développées pour produire des anticorps monoclonaux humains recombinants 12/08; la plupart d'entre eux utilisent phage display et l'immortalisation des cellules B. L'utilisation de la présentation par des phages a été largement appliquée pour la découverte de nouveaux anticorps 13. Cependant, il présente un inconvénient majeur, à savoir que les paires de chaînes lourdes et légères de l'immunoglobuline humaine devenue dissociés dans le processus. Production d'hybridomes à cellules B humaines ou de transformation EBV remédie à cet inconvénient.

Nous utilisons l'infection des cellules thymiques B par l'EBV en combinaison avec une stimulation cellulaire polyclonale B par l'intermédiaire des récepteurs Toll-like 9 (TLR-9) 6,12.

Dans cet article, nous décrivons en détail la technologie que nous utilisons pour le développement d'anticorps humains IgG, avec un aperçu complet de toutes les étapes de l'isolement de la CMSP vitro génération d'anticorps. Cetteprotocole peut être utilisé pour l'analyse de tout type de profil IgG humaine. Dans notre laboratoire, les cellules B produisant des anticorps IgG ont été séparés avec succès à partir du reste de PBMC après triage. Cinquante cellules B trié 8 peuvent ensuite être étalées dans des plaques multi-puits et immortalisées par EBV et TLR-9 activation, de l'expansion clonale de cellules B individuelles. Comme cellules nourricières, les fibroblastes provenant de tissu de poumon embryonnaire humain ont été utilisées, WI38 de lignées cellulaires, ce qui facilite la visualisation des cellules B immortalisées. A partir de ces cellules B, les séquences des chaînes lourdes et légères de l'immunoglobuline peuvent être obtenues par PCR, et les gènes d'anticorps clones dans immunoglobuline G vecteurs d'expression et produites in vitro. Grâce à cette technique, les anticorps simples avec exactement la même séquence anticorps trouvés chez le donneur peuvent être étudiés.

Protocol

Le consentement éclairé a été obtenu par les participants de l'étude. L'étude a été approuvée par le comité d'éthique institutionnelle. 1. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) Centrifugeuse 25 ml de sang héparine de participants à 900 g pendant 15 min, dès que possible après l'extraction de sang. Si il ya moins de sang, réduire les réactifs en conséquence. Effectuer toutes les prochaines étapes dans une hotte. </li…

Representative Results

Le déclenchement de tri après coloration des cellules positives CD22 et IgG est montré à la figure 1 Dans cette image le domaine des cellules doubles positives -. Lymphocytes B producteurs d'anticorps IgG – est sélectionné pour trier tous ces cellules dans un tube séparé. Dans l'analyse, environ 1% du total des CMSP correspondent à cette population positive double. Le nombre de cellules triées obtenus dépendra du nombre de cellules obtenues à l'article 1. <p class="jove_conte…

Discussion

Dans ce manuscrit, toutes les étapes de la production d'anticorps IgG à partir de PBMC humaines sont présentés en détail. Ce protocole comprend certains avantages par rapport aux techniques déjà publiés. L'un des avantages est que l'anticorps produit conserve les chaînes lourdes et légères correspondant à la paire initiale dans le clone de cellule B. L'identification des anticorps IgG peut être effectué dans tout type de donneur humain, et il n'y a pas besoin d'exacerbation de la r?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Contrat de recherche Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) à (GN-G.). Bourse de l'Organisation néerlandaise pour la recherche "Graduate School of Neuroscience Program translationnelle" scientifique (022005019) à (CH).

Les subventions du Fonds Prinses Beatrix (Projet WAR08-12) et l'Association Française contre les Myopathies à (PM-M.); ainsi que par un Veni Communauté de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (916.10.148) une bourse de la Fondation du cerveau des Pays-Bas (FS2008 (1) -28) et le Prinses Beatrix Fonds (Projet WAR08-12) (à ML ).

Nous remercions Jozien Jaspers pour son aide dans le B-tri cellulaire par cytométrie de flux.

Materials

Histopaque-1077  Sigma-Aldrich 10771 solution containing polysucrose and sodium diatrizoate
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 
96 U-bottom micro well plates  Costar 3799
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium  Gibco, Life Technologies 12633-020
30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line   ATCC CRL-1612 3.4 x 108 copies/ml
CpG2006  Invivogen ODN 7909
Wi38 cells  Sigma-Aldrich 90020107
Interleukin-2 Roche  10799068001
ELISA plates Greiner Bio-One, Microlon 655092
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) Jackson ImmunoResearch 109-006-008
4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker)  Biorad 170-6404
Human IgG  Sigma I 2511 HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml
Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) Jackson ImmunoResearch 109-036-008
ELISA reader (Perkin Elmer 2030)  Perkin Elmer  2030-0050
Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ  Jackson ImmunoResearch 309-035-095
SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System  Invitrogen  18080-200
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 Applied Biosystems
High Pure RNA Isolation Kit  Roche 11828665001
Reverse transcription system kit  Promega A3500
Recombinant Taq DNA Polymerase TAKARA R001A
Primers (2μl) Sigma
Ultrapure Agarose  Invitrogen 16500-500
100 bp ladder Invitrogen 15628-019
Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) Biorad 170-8100
QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28106
BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit  Applied Biosystems 4337455
0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) Applied Biosystems 4346906
Genetic analyser ABI300  Applied Biosystems 4346906
DH5α competent cells (E. coli) Invitrogen 18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp) Invivogen pfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp)  Invivogen pfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp) Invivogen pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp)  Invivogen pfuse2ss-hcll2
SOC medium Invitrogen 15544-034
LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) Invivogen fas-zn-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) Invivogen fas-zn-l
DNA Miniprep kit  Omega Bio Technology D6942-02
Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) Nanodrop
LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) Invivogen fas-bl-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) Invivogen fas-bl-l
EcoRI New England Biolabs R0101S 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI
NheI New England Biolabs R0131S 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA ladder New England Biolabs N3200S 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml
XmaI New England Biolabs R0180S 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
BsiWI New England Biolabs R0553S 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1
AvrII New England Biolabs R0174S 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 1 U/µL, in 10x FastAP Buffer
DH5α competent cells  Invitrogen 18263-012
PE Mouse Anti-Human IgG BD Pharmingen 555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 Fisher scientific BDB563942
QIAprep Spin Miniprep Kit  QIAGEN 27106
BigDye Terminator v3.1 Applied Biosystems 4337455

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Nogales-Gadea, G., Saxena, A., Hoffmann, C., Hounjet, J., Coenen, D., Molenaar, P., Losen, M., Martinez-Martinez, P. Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells. J. Vis. Exp. (100), e52830, doi:10.3791/52830 (2015).

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