Summary

Generering van recombinant humaan IgG Monoclonal Antibodies uit Onsterfelijk gesorteerde B Cells

Published: June 05, 2015
doi:

Summary

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Abstract

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Introduction

Het doel van dit artikel is in detail te beschrijven een methode voor het genereren en karakteriseren van humane IgG monoklonale antilichamen verkregen uit humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC).

De belangstelling voor de menselijke antilichamen studeren is gegroeid in veel verschillende gebieden van het onderzoek. Met name veel onderzoeksgroepen zijn geïnteresseerd in de pathologie veroorzaakt door auto-antilichamen 1-3. We hebben gekloneerd en gekarakteriseerd pathogene autoantilichamen 1. De studie van autoantilichamen kunnen helpen om hun doelen te identificeren en therapeutische strategieën te ontwikkelen, bijvoorbeeld door het gebruik deelnemer 4 antilichamen. Bovendien kan de studie van humane antilichamen ook interesse in andere onderzoeksgebieden, dat wil zeggen, om de immuunreactie na vaccinatie te evalueren 5, het antilichaamprofiel van individuen die werden blootgesteld en werd resistent tegen specifieke pathogenen 6 of een studie karakteriseren welke antilichamen inde natuurlijke repertoire 7,12.

Verscheidene technieken zijn ontwikkeld om recombinante humane monoklonale antilichamen 8-12 genereren; de meeste van deze te gebruiken faagdisplay en B-cel immortalisatie. Het gebruik van faagdisplay is uitgebreid toegepast voor de ontdekking van nieuwe antilichamen 13. Zij heeft echter een groot nadeel, namelijk dat de zware en lichte keten paren van de humane immunoglobuline wordt gedissocieerd in het proces. Productie van hybridoma's met humane B cellen of EBV transformatie ondervangt dit bezwaar.

We gebruiken infectie van thymus B-cellen met EBV in combinatie met polyklonale B-cel stimulatie via Toll-like receptor 9 (TLR-9) 6,12.

In dit artikel beschrijven we in detail de technologie die we gebruiken voor de ontwikkeling van IgG humane antilichamen, met een compleet overzicht van alle stappen van PBMC isolatie om de in vitro antilichaam generatie. Dezeprotocol kan worden gebruikt voor de analyse van elk type humaan IgG profiel. In ons laboratorium hebben B cellen die IgG antilichamen met succes gescheiden van de rest van PBMCs na sortering. Vijftig gesorteerd 8 B-cellen kunnen vervolgens worden uitgeplaat in multi-well platen en geïmmortaliseerd door EBV en TLR-9 activering gedurende de klonale expansie van afzonderlijke B-cellen. Zoals voedingscellen zijn fibroblasten van humane embryonale longweefsel gebruikt, cellijn WI38, waarbij de visualisatie van de geïmmortaliseerde B-cellen vergemakkelijkt. Uit deze B-cellen, kunnen de sequenties van de zware en lichte ketens van het immunoglobuline worden verkregen door PCR, en genen de antilichamen "immunoglobuline G gekloneerd in expressievectoren en in vitro geproduceerd. Met deze techniek kan enige antilichamen met dezelfde antilichaamsequentie in de donor worden bestudeerd.

Protocol

Geïnformeerde toestemming is verkregen van de deelnemers van het onderzoek. Het onderzoek werd goedgekeurd door de institutionele ethische commissie. 1. Isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) Centrifugeer 25 ml gehepariniseerd bloed van de deelnemers bij 900 xg gedurende 15 min, zo spoedig mogelijk na de bloedextractie. Als er minder bloed, de schaal van de reagentia dienovereenkomstig. Voer alle volgende stappen in een kap. Breng het serum een ​​s…

Representative Results

Het sorteren gating na kleuren CD22- en IgG positieve cellen wordt getoond in figuur 1 In dit beeld het gebied van de dubbele positieve cellen -. B cellen die IgG antilichamen – is geselecteerd om al deze cellen in een afzonderlijke buis sorteren. In de analyse, ongeveer 1% van de totale PBMC's overeenkomen met deze dubbele positieve populatie. Het aantal gesorteerde cellen verkregen hangt af van het aantal cellen verkregen in deel 1. De verschillende resultaten na 5 wek…

Discussion

In dit manuscript worden alle stappen voor het genereren van IgG-antilichamen uit humane PBMCs gedetailleerd besproken. Dit protocol bevat een aantal voordelen ten opzichte van eerder gepubliceerde technieken. Eén van de voordelen is dat de aanwezigheid van antilichamen houdt de zware en lichte ketens die overeenkomen met de oorspronkelijke pair in de B-cel kloon. De identificatie van IgG-antilichamen kan worden uitgevoerd in elk type van menselijke donor, en er is geen behoefte aan verergering van de immuunrespons doo…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Onderzoek contract Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) naar (GN-G.). Fellowship uit Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek "Graduate School Translationele Neurowetenschappen Program" (022005019) tot (CH).

Subsidies van het Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) en de Association Française contre les Myopathies naar (PM-M.); alsmede door een Veni Fellowship van Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (916.10.148) een gemeenschap van de Hersenstichting Nederland (FS2008 (1) -28) en het Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) (ML ).

Wij danken Jozien Jaspers voor haar hulp in de B-celsortering door middel van flowcytometrie.

Materials

Histopaque-1077  Sigma-Aldrich 10771 solution containing polysucrose and sodium diatrizoate
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 
96 U-bottom micro well plates  Costar 3799
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium  Gibco, Life Technologies 12633-020
30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line   ATCC CRL-1612 3.4 x 108 copies/ml
CpG2006  Invivogen ODN 7909
Wi38 cells  Sigma-Aldrich 90020107
Interleukin-2 Roche  10799068001
ELISA plates Greiner Bio-One, Microlon 655092
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) Jackson ImmunoResearch 109-006-008
4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker)  Biorad 170-6404
Human IgG  Sigma I 2511 HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml
Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) Jackson ImmunoResearch 109-036-008
ELISA reader (Perkin Elmer 2030)  Perkin Elmer  2030-0050
Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ  Jackson ImmunoResearch 309-035-095
SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System  Invitrogen  18080-200
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 Applied Biosystems
High Pure RNA Isolation Kit  Roche 11828665001
Reverse transcription system kit  Promega A3500
Recombinant Taq DNA Polymerase TAKARA R001A
Primers (2μl) Sigma
Ultrapure Agarose  Invitrogen 16500-500
100 bp ladder Invitrogen 15628-019
Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) Biorad 170-8100
QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28106
BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit  Applied Biosystems 4337455
0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) Applied Biosystems 4346906
Genetic analyser ABI300  Applied Biosystems 4346906
DH5α competent cells (E. coli) Invitrogen 18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp) Invivogen pfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp)  Invivogen pfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp) Invivogen pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp)  Invivogen pfuse2ss-hcll2
SOC medium Invitrogen 15544-034
LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) Invivogen fas-zn-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) Invivogen fas-zn-l
DNA Miniprep kit  Omega Bio Technology D6942-02
Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) Nanodrop
LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) Invivogen fas-bl-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) Invivogen fas-bl-l
EcoRI New England Biolabs R0101S 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI
NheI New England Biolabs R0131S 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA ladder New England Biolabs N3200S 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml
XmaI New England Biolabs R0180S 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
BsiWI New England Biolabs R0553S 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1
AvrII New England Biolabs R0174S 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 1 U/µL, in 10x FastAP Buffer
DH5α competent cells  Invitrogen 18263-012
PE Mouse Anti-Human IgG BD Pharmingen 555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 Fisher scientific BDB563942
QIAprep Spin Miniprep Kit  QIAGEN 27106
BigDye Terminator v3.1 Applied Biosystems 4337455

Referenzen

  1. Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
  2. Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
  3. Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
  4. Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
  5. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  6. Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
  7. Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
  8. Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
  9. Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
  10. Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
  11. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  12. Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
  13. Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
  14. Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan … [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
  15. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
  16. Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
  17. Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321 (2011).
  18. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Nogales-Gadea, G., Saxena, A., Hoffmann, C., Hounjet, J., Coenen, D., Molenaar, P., Losen, M., Martinez-Martinez, P. Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells. J. Vis. Exp. (100), e52830, doi:10.3791/52830 (2015).

View Video