Bir Aquatic Mikrobiyal Metaproteomics İş Akışı: Tandem Kütle Spektrometre tabanlı analiz için uygun Triptik Peptitler için Hücreleri itibaren
Summary
This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.
Abstract
Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.
Introduction
Mikroorganizmalar her yerde ve Dünya'nın biyokimyasal döngüler 1 temel rol oynamaktadır. Şu anda, mikrobiyal topluluk yapısını ve işlevini tanımlamak için kullanılabilir birçok moleküler yaklaşımlar vardır. 4 – En yaygın 16S rRNA geninin analizi, çevre DNA 2 PCR ile amplifiye dizileri. 16S rRNA gen analizi bir dezavantajı sadece bir metabolik fonksiyonu ile ilgili çok az bilgi, filogenetik kimlik ve toplum yapısı hakkında bilgi temin etmesidir. Metagenomik, metatranscriptomics ve metaproteomics toplum yapısı ve metabolizma hakkında bilgi vermek olarak tersine, bu tür yaklaşımları. 8 – Metagenomiks veya organizmaların bir topluluğu gen içeriğinin analizi, toplum 5 yapısı ve fonksiyonel potansiyeli hakkında bilgi sağlar. Güçlü olmasına rağmen, bu fonksiyonel potansiyeli metabolik uygun olmayabilirorganizmaların faaliyetleri. Bir organizmanın genotipi RNA'ya transkribe ve ayrıca bir fenotipe yol açacak şekilde proteine tercüme edilebilir, her biri kendi gen tarafından temsil edilmektedir. Bu nedenle, bir ortamda mikrop fonksiyonel aktivite anlaşılmasına yardım etmek için, post-genomik analizi 9 yapılmalıdır. Bu, herhangi bir ortamda transkripsiyonu hangi genlerin ortaya için Metatranscriptomics ya da RNA transkriptlerinin analizinin yararlıdır. Ancak, mRNA düzeyleri nedeniyle her zaman öteleme yönetmelik, RNA yarılanma ömrü ve birden çok protein kopyaları her mRNA 10 oluşturulabilir gerçeğini bunlara karşılık gelen protein düzeyleri uyuşmuyor.
Bu nedenlerle metaproteomics için artık çevre mikrobiyolojisi için önemli bir araç olarak kabul edilmektedir. Ortak metaproteomic karmaşık bir numunede proteinlerin yakın tam tamamlayıcı genellikle tr aracılığıyla, saflaştırılmış ve eş zamanlı olarak analiz edilir bir tüfek proteomik yaklaşım kullanır analizleriBir kütle spektrometresi üzerinde peptitler ve analize Enzimatik sindirim. Daha sonra bir tandem kütle spektrometrisi (MS / MS) "peptit parmak izi" arama protein veritabanı tarafından peptid dizisi ve kaynaklı olası protein (Bir inceleme için bakınız 11) belirlemek için kullanılır. Proteomik iş genomik veri kullanılabilirliği artış ve hassasiyet ve yüksek verimli protein tanımlanması ve ölçümü 11,12 sağlayan kitle spektrometre doğruluğu artışa geçmiş 25 yıl sayesinde uzun bir yol kat etti. Proteinler gen ifadesinin nihai ürün olduğundan, metaproteomic veriler herhangi bir ortamda ve hangi proteinler dile getiriyorlar aktif olan organizmalar belirlemenize yardımcı olabilir. Çevresel değişkenler belirli bir dizi bir organizmanın ya da topluluğun fenotip nasıl etkileyeceğini belirlemek için çalışırken bu avantajlıdır. Erken, okyanusta MS / MS-tabanlı metaproteomic çalışmalarda hedeflenen belirli proteinleri belirlemek için kullanıldıSAR11 deniz bakteri 13 ışık tahrik proton pompa proteorhodopsin odaklanan ilk çalışma ile mikrobiyal soy. Daha yakın zamanlarda, karşılaştırmalı analizler metaproteomic karmaşık topluluklar arasındaki fark protein ekspresyonu aydınlatmıştır. Örnekler kıyı Kuzeybatı Atlantik Okyanusu 14 veya Antarktika Yarımadası'nın 5 metabolizmasında zamansal değişimlerin belirlenmesini içermektedir. Diğer çalışmalar son derece verimli kıyı upwelling sistemine 15 düşük besin okyanus gyre bir coğrafi transekt boyunca, örneğin, mekansal ölçekler arasında protein ekspresyonu varyasyonları nitelendirdiler. Metaproteomics daha değerlendirme için biz Schneider vd., (2010), 9 ve Williams ve ark. (2014) 16 önerilir. Hedeflenen proteomiks ayrıca çevre 17,18 belirli metabolik yollar ifadesini ölçmek için son yıllarda istihdam edilmiştir.
Thermetaproteomic analizde üç ana aşamalar e bulunmaktadır. İlk aşama, örnek toplama hücre parçalanması ve protein konsantrasyonu içeren örnek hazırlama vardır. Deniz mikrobiyoloji örnek toplama yaygın haliyle, bir 0.22 mikron kartuş kullanımı ile, serbest yaşayan mikrobiyal hücrelerin yakalanması için, süzme, ardından daha büyük bir ökaryotik hücreler, partikül ve partikül ilişkili bakteriler kaldırmak için bir ön-filtre, geçen deniz filtrasyon gerektirir Filtre ünitesi 19,20. Bu filtreler, plastik bir silindir incased edilmiştir ve filtre birimi içinde yapılabilir, bir hücre parçalama ve protein ekstre protokolü değerli bir araç olabilir. Biyokütle elde edildikten sonra, hücreler, protein ekstraksiyonu sağlamak için lize gerekir. Çeşitli yöntemler guanidin-HCl çözme 21 sodyum dodesil sülfat (SDS) tabanlı parçalama yöntemleri de dahil olmak üzere, kullanılabilir. SDS gibi deterjanlar, dikkat yoğunluğu birçok protein türleri zarları engellemeden ve çözülebilen çok verimli olmasına rağmen% 0.1 aşağı protein sindirimi ve MS analizi 22 ile müdahale gibi düşük ons. Önemli bir endişe iyon kaynağı 23 içindeki ters faz sıvı kromatografisi ve iyon bastırılması veya birikim çözme gücü, tripsin sindirim verimliliği üzerinde SDS olumsuz etkilerdir.
İkinci faz proteinleri, ilk triptik peptid primer amino asit dizisini belirlemek için kullanılabilir am / z parçalanma örnekle sonuçlanan, LC MS / MS analizi ile izlenmiştir enzimatik sindirme tabi tutulur fraksiyonasyon ve analizdir. Çeşitli sindirim yöntemleri kullanılmıştır deterjan tipleri, hem de aşağı doğru kütle spektrometrisi akışı bağlı olarak gerçekleştirilebilir. Protokolde, jelden SDS ile uzaklaştırılarak elde edilmiş 1-D PAGE elektroforez herhangi bir deterjan kontaminasyonu ortadan kaldırmak için kullanılmaktadır. , Membran proteinleri gibi, çözündürülmesi zordur proteinlerin analiz, yüksek konsantre ve kullanımını gerektirirSDS veya diğer deterjan yerel yönetim bu. Bu, SDS-jel elektroforezi ile uyumluluk sorunları yol açar. Bir çalışmanın amacı, proteinleri çözmek için bu zor çözünür hale gerektiriyorsa, tüp jel sistemi, 22,24 kullanılabilir. Tüp jel elektroforezi yöntemi kullanılmadan edilmiş jel matrisi içinde protein içerir. Ardından çözünürlük için kullanılan herhangi bir deterjanlar protein sindirimi önce kaldırılır.
Üçüncü aşama biyoinformatik analizi. Bu aşamada, MS / MS verileri peptid peptidler ve proteinler numunede mevcut olan belirlemek için çevrilen nükleotid dizilerinin bir veri tabanına karşı araştırılmıştır. Peptidler tanımlanması o karşı aranır veritabanı bağlıdır. Deniz metaproteomic veriler genellikle referans genomları, Küresel Okyanus Örnekleme veri kümesi 25 olarak metagenomic veriler yanı sıra ekilmemiş li gelen tek bir hücre amplifiye genomları oluşan veritabanları karşı aranır26,27 neages. Metaproteomic veriler 5 türetilmiş gibi protein tanımlanması aynı örnekten metagenomic dizilerin dahil edilmesi ile artırılabilir.
Burada mikrop biyokütle MS / MS-tabanlı analizi için uygun peptidler, süzme ile toplanmış ve bir RNA stabilizasyonu çözelti içinde depolanan üretimi için bir protokol sağlar. Burada açıklanan protokol DNA ve protein tüm adımları proteine yol açan DNA çökelme aynıdır, böylece aynı numuneden izole edilmesi sağlar. Sadece bir filtre protein ve DNA izolasyonu hem de gerekli olduğundan pratik açıdan bakıldığında, daha az filtrasyon gereklidir. Biz de bu protokol iki önce yayınlanmış protokolleri kombinasyonu, adaptasyon ve modifikasyon yoluyla yaratılmış olduğunu kabul etmek istiyorum. Hücre parçalama adımlar (2011) 28. Saito ve ark uyarlanan ve bileşeni sindirmek in-jel tripsin Shevche uyarlanmıştırNKO ve diğ. (2007) 29.
Protocol
Representative Results
Discussion
Örnek korunması metaproteomic çalışmalara anahtarıdır ve önceki iş bir RNA stabilizasyonu çözümü öncesinde protein ekstraksiyon 28 hücreleri saklamak için kullanışlı bir depolama tampon olduğunu göstermiştir. İdeal olarak, numuneler 33,34 taşıma sırasında protein ifadesindeki vardiya inkâr yerinde korunmuş olacaktır. Aslında, yerinde numune alma ve sabitleme teknolojileri gemi dağıtılan araçlarla özerk toplama ve numunelerin saklanması için iz…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.
Materials
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2mL ROBO vial 9mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
Referenzen
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
- Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
- Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).
- Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6 (10), (2012).
- Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).
- Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
- Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
- Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).
- Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).
- Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al. Proteorhodopsin in the ubiquitous marine bacterium SAR11. Nature. 438 (7064), 82-85 (2005).
- Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. , 1-13 (2014).
- Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).
- Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).
- Saito, M. a., McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).
- Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).
- Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, 305-329 (2013).
- Da Walsh, ., Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
- Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).
- Lu, X., Digestion Zhu, H. . Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).
- Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).
- Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of “Candidatus Nitrosopelagicus brevis”: An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).
- Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5 (3), e77 (2007).
- Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).
- Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).
- Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics – a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).
- Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).
- Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -. J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).
- Ea Ottesen, ., Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).
- Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).
