Водной Микробная Metaproteomics рабочего процесса: от клеток до триптической пептидов Подходит для тандемной масс-спектрометрии на основе анализа

Микроорганизмы вездесущи и играют существенную роль в биогеохимических циклах Земли ^1. В настоящее время существует множество подходов молекулярной доступные для характеристики структуры микробного сообщества и функции. Наиболее распространенным является анализ гена 16S рРНК ПЦР-амплифицировали из ДНК окружающей среды ^{2 – 4.} Недостатком анализа генов 16S рРНК, что это только предоставляет информацию о филогенетического идентичности и структуры сообществ, с мало информации о метаболической функции. В отличие от этого, подходов, таких как метагеномика, metatranscriptomics и metaproteomics предоставить информацию о структуре и метаболизме сообщества. Метагеномика, или анализ содержания генов в сборке организмов, дает информацию о структуре и функциональным возможностям сообщества ^{5 – 8.} Несмотря на то, мощный, это функциональный потенциал может не соответствовать метаболическихДеятельность организмов. Генотип организма представлена ​​его генов, каждый из которых может быть транскрибируется в РНК и затем переведены на белок, в результате чего фенотип. Таким образом, чтобы помочь в понимании микробной функциональной активности в среде, после геномный анализ должен быть выполнен ^9. Metatranscriptomics или анализ РНК-транскриптов является полезным, поскольку он показывает, какие гены транскрибируются в любой среде. Тем не менее, уровни мРНК не всегда совпадают соответствующие их уровни белка за счет поступательного регулирования, РНК полураспада, и в том, что несколько белков копии могут быть сформированы для каждого мРНК ^10.

По этим причинам metaproteomics в настоящее время признается в качестве важного инструмента для микробиологии окружающей среды. Общие metaproteomic анализирует использовать дробовик протеомный подход, при котором рядом с полным комплектом белков в комплексе образца очищают и проанализированы одновременно, как правило, через анzymatic пищеварения в пептиды и анализа на масс-спектрометре. После тандемной масс-спектрометрии (МС / МС) "пептид отпечатков пальцев" используется для определения пептидную последовательность и потенциальную белок происхождения по базе данных белков поиск (для обзора см ^11). Протеомный работа долгий путь за последние 25 лет благодаря увеличению доступности данных геномной и увеличения чувствительности и точности масс-спектрометров, позволяющих идентификации белков с высокой пропускной и количественного ^11,12. Так белки конечный продукт экспрессии гена, metaproteomic данные могут помочь определить, какие организмы являются активными в любой среде, и какие белки они выражают. Это выгодно, когда пытаются определить, как конкретный набор параметров окружающей среды влияет на фенотип организма или сообщества. Ранее, МС / МС на основе metaproteomic исследования в океане были использованы для выявления специфических белков в целевыхмикробные клоны, с первого исследования, посвященного света приводом протонного насоса proteorhodopsin в SAR11 морских бактерий. ¹³ Совсем недавно, сравнительные анализы metaproteomic выяснены дифференциальные паттерны экспрессии белка между сложными сообществами. Примеры включают в себя идентификацию временных сдвигов в обмене веществ в прибрежной Северо-Западного Атлантического океана ^{14 или} Антарктического полуострова ^5. Другие исследования описаны изменения в белковых паттернов экспрессии по пространственных масштабах, например, вдоль географического разреза от низкой питательной океана круговорота в высокопроизводительной системе прибрежного апвеллинга ^15. Для дальнейших обзоров metaproteomics мы рекомендуем Шнайдер и др. (2010) ⁹ и Уильямс и др. (2014) ^16. Целевые протеомики также использованы в последние годы для количественного экспрессии специфических метаболических путей в среде ^17,18.

Therе три основные фазы в metaproteomic анализа. Первый этап подготовки образца, который включает в себя взятие проб, лизис клеток и концентрации белка. Сбор образцов в морской микробиологии часто влечет за собой фильтрацию морской воды через предварительный фильтр для удаления более крупных эукариотических клеток, частиц и частиц-ассоциированных бактерий, с последующей фильтрацией для захвата свободных живой микробных клеток, обычно с использованием картриджа 0,22 мкм Фильтрующий блок ^19,20. Эти фильтры incased в пластиковом цилиндре и лизис клеток и протокол экстракции белка, который может быть выполнен в блоке фильтров будет ценным инструментом. После биомасса получена, клетки лизируют необходимо для обеспечения извлечения белка. Могут быть использованы различные способы, в том числе гуанидин-HCl лизиса ²¹ и натрия додецилсульфата (SDS) основе методов лизиса. Несмотря на то, моющие средства, такие как SDS являются очень эффективными на срыв мембраны и растворении многих типов белковых, КонцентрацONS цене 0,1% может помешать с выходным пищеварения белков и анализа MS ^22. Серьезную озабоченность является негативное воздействие на SDS трипсина эффективности пищеварения, разрешающая способность обратной фазы жидкостной хроматографии и подавления ионов или накопления внутри источника ионов ^23.

Вторая фаза фракционирования и анализ, в котором белки подвергают ферментативному расщеплению с последующим анализом ЖХ МС / МС, в результате чего AM / г структуры фрагментации, который может использоваться, чтобы установить первичный аминокислотную последовательность начальной трипсином пептида. Различные методы пищеварения могут быть выполнены в зависимости от типов используемых моющих средств, а также вниз по течению процесса массового спектрометрии. В нашем протокола, 1-D электрофореза PAGE с последующим удалением SDS из геля используется для удаления любых загрязнений моющего средства. Анализ белков, которые трудно растворить, например, мембранные белки, требует использования высокой концентратраций SDS или других моющих средств. Это приводит к проблемам совместимости с SDS-электрофореза в геле. Если цель исследования требует солюбилизации эти трудно растворить белки, система трубки-гель может быть использован ^22,24. Способ трубки-гель включает белки в матрице геля без использования электрофореза. Впоследствии любые моющие средства, используемые для растворения удаляются перед переваривания белков.

Третий этап является биоинформатики анализ. На этом этапе данные пептидные MS / MS ищутся в базе данных переведенных нуклеотидных последовательностей для определения пептиды и белки присутствуют в образце. Идентификация пептидов зависит от базы данных оно искали против. Морские metaproteomic данные обычно искали с базами данных, состоящих из опорных геномов, метагеномных данных, таких как Global Ocean Sampling наборе ^25, а также одноклеточные усиливается геномов из необработанной Lineages ^26,27. Белки также идентификацию может быть увеличена за счет включения в метагеномных последовательностей из того же образца, как metaproteomic данные были получены ^5.

Здесь мы предлагаем протокол для генерации пептидов, пригодных для МС / МС анализа на основе биомассы из микробных собирали фильтрованием и хранящихся в растворе стабилизации РНК. Протокол, описанный здесь, обеспечивает ДНК и белка, которые будут выделены из того же образца, так что все шаги, ведущей к белку и осадки ДНК идентичны. С практической точки зрения, менее фильтрации требуется, так как только один фильтр необходим для белка и экстракции ДНК. Мы также хотели бы отметить, что этот протокол был создан благодаря сочетанию, адаптации и модификации двух ранее опубликованных протоколов. Шаги лизиса клеток адаптированы из Саито и соавт. (2011) ²⁸ и трипсина в геле переварить компонент приспособлен от ShevcheНКО и др. (2007) ^29.