Metaproteomics זרימת עבודה Aquatic מיקרוביאלית: מתאים לtryptic פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסת טנדם

מיקרואורגניזמים נמצאים בכל מקום ולשחק תפקידים חיוניים במחזורי biogeochemical של כדור הארץ ^1. נכון לעכשיו, יש גישות מולקולריות רבות זמינות לאפיון מבנה קהילת חיידקים ותפקוד. הנפוץ ביותר הוא הניתוח של גן 16S rRNA רצפי PCR-מוגבר מ- DNA הסביבתי ^{2 – 4.} חסרון של ניתוח גנטי 16S rRNA הוא שזה רק מספק מידע על זהות פילוגנטי ומבנה קהילה, עם מעט מידע על תפקוד מטבולים. לעומת זאת, גישות כגון metagenomics, metatranscriptomics וmetaproteomics לספק מידע על מבנה קהילה וחילוף חומרים. Metagenomics, או הניתוח של תוכן הגן של מכלול של אורגניזמים, מספק מידע על המבנה ואת הפוטנציאל התפקודי של הקהילה ^{5 – 8.} למרות עוצמה, פוטנציאל פונקציונלי זה לא מתאים מטבוליםפעילות של אורגניזמים. גנוטיפ של האורגניזם מיוצג על ידי הגנים שלו, כל אחד מהם יכול להיות עיבד ותרגמו לרנ"א לחלבון נוסף, וכתוצאה מכך פנוטיפ. לכן, כדי לסייע בהבנה של פעילות פונקציונלית של חיידקים בסביבה, ניתוח שלאחר הגנומי צריך להתבצע ^9. Metatranscriptomics, או הניתוח של תעתיקי רנ"א הוא שימושי משום שהוא חושף שגנים מתועתקים בכל סביבת נתונה. עם זאת, רמות ה- mRNA לא תמיד תואמות את רמות החלבון המתאימים בשל רגולציה translational, RNA מחצית חיים, והעובדה שעותקים חלבון מרובים יכולים להיות שנוצרו עבור כל mRNA ^10.

לmetaproteomics מסיבות אלה מוכר כיום ככלי חשוב למיקרוביולוגיה הסביבתית. הנפוץ metaproteomic מנתח להשתמש בגישת proteomic רובה שבו ההשלמה מלאה ליד של חלבונים במדגם מורכב הם מטוהרים ונותחה בו-זמנית, בדרך כלל באמצעות enעיכול zymatic לפפטידים וניתוח על ספקטרומטר מסה. ספקטרומטר מסת טנדם לאחר (MS / MS) "טביעת אצבע פפטיד" משמשת כדי לקבוע את רצף הפפטיד וחלבון פוטנציאלי ממוצא ידי מסד נתוני חלבון חיפוש (לסקירה ראה ^11). עבודת proteomic יש כברת דרך ארוכה ב -25 השנים האחרונות הודות לעלייה בזמינויות הנתונים הגנומי והעלייה ברגישות והדיוק של ספקטרומטרים המוניים המאפשרים זיהוי חלבון תפוקה גבוהה וכימות ^11,12. מאז חלבונים הם המוצר הסופי של ביטוי גנים, נתונים metaproteomic יכולים לעזור לקבוע אילו אורגניזמים פעילים בכל סביבה ומה חלבונים הם מביעים נתון. זהו יתרון כאשר מנסים לקבוע איך קבוצה מסוימת של משתנים סביבתיים תשפיע על הפנוטיפ של האורגניזם או קהילה. בשלב מוקדם, מחקרי metaproteomic מבוססי MS MS / בים היו משמשים לזיהוי חלבונים ספציפיים בממוקדשושלות חיידקים, עם המחקר הראשון מתמקד בproteorhodopsin משאבת פרוטון האור מונע בחיידקים הימיים SAR11 ^13. לאחרונה, ניתוחי metaproteomic השוואתיים שהובהרו דפוסי ביטוי חלבון ההפרש בין קהילות מורכבות. דוגמאות כוללות זיהוי של משמרות זמניות בחילוף חומרים בצפון-מערב האוקיינוס ​​האטלנטי חוף ¹⁴ או חצי האי האנטארקטי ^5. מחקרים אחרים תיארו שינויים בדפוסי ביטוי חלבון על פני קשקשים מרחבית, למשל, לרוחב, גיאוגרפי מסיבובי אוקיינוס ​​נמוך תזונתיים למערכת upwelling חוף פרודוקטיבי ^15. לביקורות נוספות של metaproteomics אנו ממליצים שניידר et al. (2010) ⁹ ווויליאמס et al. (2014) ^16. פרוטאומיקה ממוקדת גם הועסקה בשנים האחרונות לכמת ביטוי של מסלולי מטבוליים מסוימים בסביבה ^17,18.

Therדואר שלושה שלבים עיקריים בניתוח metaproteomic. השלב הראשון הוא הכנת מדגם, הכוללת איסוף דגימה, תמוגה תא וריכוז של חלבון. אוסף מדגם במיקרוביולוגיה הימית לעתים קרובות כרוך בסינון של מי ים דרך מראש מסנן כדי להסיר תאים גדולים יותר אוקריוטים, חלקיקים וחיידקים הקשורים חלקיקים, ואחרי סינון ללכידתו של תאי חיידקי חיים חופשיים, בדרך כלל עם השימוש במחסנית 0.22 מיקרומטר יחידת מסנן ^19,20. מסננים אלה עטויות כפפה בגליל פלסטיק ותמוגה תא ופרוטוקול מיצוי חלבון שניתן לבצע בתוך יחידת המסנן יהיה כלי רב ערך. ברגע שמתקבלת ביומסה, התאים חייבים להיות lysed כדי לאפשר מיצוי חלבון. יכולים להיות מועסקים במספר שיטות, כולל סולפט guanidine-HCl dodecyl תמוגה ²¹ ונתרן (SDS) שיטות תמוגה מבוססות. למרות שחומרי ניקוי כמו SDS הם מאוד יעילים בשיבוש קרומים וsolubilizing סוגים רבים חלבון, concentratiONS נמוך כמו 0.1% יכולים להפריע לעיכול חלבון במורד הזרם וניתוח MS ^22. דאגה עיקרית הוא ההשפעות השליליות של SDS על יעילות עיכול טריפסין, פתרון כוח של כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה שלב ודיכוי יון או הצטברות בתוך יון המקור ^23.

השלב השני הוא חלוקה וניתוח, שבו חלבוני נתונים לעיכול אנזימטי ואחרי ניתוח LC MS / MS, וכתוצאה מכך דפוס פיצול בבוקר / z שניתן להשתמש בי לברר את רצף חומצות אמינו העיקרי של הפפטיד tryptic הראשוני. ניתן לבצע שיטות עיכול שונות בהתאם לסוגים של חומרי ניקוי המשמשים, כמו גם את העבודה ספקטרומטר מסה במורד הזרם. בפרוטוקול שלנו, אלקטרופורזה עמוד 1-D ואחריו ההסרה של SDS מג'ל מנוצלת כדי להסיר כל זיהום חומר ניקוי. הניתוח של חלבונים שקשה solubilize, כגון חלבוני קרום, מחייב השימוש גבוה concentrations של SDS או חומרי ניקוי אחרים. זה מוביל לבעיות תאימות עם אלקטרופורזה SDS-ג'ל. אם מטרתו של מחקר דורשת solubilization קשה אלה לsolubilize חלבונים, מערכת הצינור-ג'ל ניתן להשתמש ^22,24. שיטת הצינור-ג'ל משלבת חלבונים בתוך מטריצת ג'ל ללא השימוש באלקטרופורזה. בהמשך לכך כל חומרי ניקוי המשמש לsolubilization יוסרו לפני עיכול חלבון.

השלב השלישי הוא ניתוח bioinformatic. בשלב זה נתונים פפטיד MS / MS הם חיפשו מול מסד נתונים של רצפי נוקליאוטידים תרגמו כדי לקבוע אילו פפטידים וחלבונים נמצאים במדגם. זיהוי של פפטידים תלוי בבסיס הנתונים שהוא חיפש נגד. נתונים metaproteomic ימיים חיפשו נפוצים מול מסדי נתונים מורכבים מהגנום התייחסות, נתונים metagenomic כגון בסיס הנתונים הגלובלי אוקיינוס ​​דגימת ^25, כמו גם הגנום תא מוגבר אחד מli הבורneages ^26,27. זיהוי חלבון גם יכול להיות מוגבר על ידי ההכללה של רצפי metagenomic מאותו המדגם נתונים metaproteomic נגזר ^5.

כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור הדור של פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס MS MS / ביומסה חיידקים שנאספו על ידי סינון ומאוחסנים בפתרון ייצוב RNA. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לדנ"א וחלבון להיות מבודדים מאותו המדגם, כך שכל הצעדים שהובילו לחלבון ומשקעי DNA זהים. מנקודת מבט מעשית, נדרש פחות סינון שכן רק אחד מסנן נדרש לחלבון וגם מיצוי DNA. אנחנו רוצים גם להודות שפרוטוקול זה נוצר באמצעות שילוב, עיבוד והשינוי של שני פרוטוקולים שפורסמו בעבר. צעדי תמוגה התא מותאמים מאל סאיטו et. (2011) ²⁸ וטריפסין ב- ג'ל לעכל רכיב מותאם ShevcheNKO et al. (2007) ^29.