Um novo aplicativo do Electrical Penetration Graph (EPG) para aquisição e medição de sinais elétricos em Floema Sieve Elements

A capacidade para produzir sinais eléctricos de longa distância é uma característica vantajosa de organismos multi-celulares que permite respostas eficientes a estímulos externos. Esta característica tem evoluído independentemente em plantas e animais, e representa, portanto, um processo de evolução convergente. Dado que os sinais eléctricos são acoplados com funções importantes em animais, tais como a transmissão neuronal e a contracção muscular, a base molecular, o mecanismo de transmissão, e a função de sinais eléctricos induzidos por estímulos em animais são sujeitos de pesquisa intensiva. Em contraste, induzida por estímulo sinalização elétrica em plantas tem recebido pouca atenção da investigação. Embora as plantas não têm nervos ou músculos, parece haver provas suficientes para assumir que os sinais elétricos induzida por estímulo em plantas desempenham um papel fundamental nas suas respostas aos factores ambientais.

O floema, o componente vivo da vasculatura planta, tem sido postulada como uma das principais substrate para a transmissão de sinais eléctricos induzidos por estímulos, a partir estimulada / danificado para áreas não estimuladas intactas / ^2. As principais células do floema são os elementos de peneira (SES), células alongadas, relativamente simples. As extremidades das SEs estão ligados a outro SEs, formando um contínuo, de baixa resistência, sistema de tubo de peneira que se espalha por toda a planta. Há, no entanto, muito poucos estudos sobre as propriedades elétricas dessas células altamente especializadas. Nesses estudos anteriores, os pesquisadores acessada SEs com qualquer vidro micro-eletrodos ³ estiletes ou com eletrodos de vidro que foram acoplados a plantar-inseridos de pulgões, após stylectomy (corte) ^4. Microeléctrodos de vidro são feitas a partir de capilares de vidro que são puxados numa extremidade com calor para uma ponta fina de menos do que 1 um de diâmetro, e depois encheram-se com uma solução de KCl. Um fio de Ag / AgCl ou platina, inserido no eléctrodo de vidro de KCl cheio é então ligado à entrada do amplificador, e um referenteeléctrodo for inserido no banho em torno da célula de interesse, completando o circuito. Esta configuração regista a diferença de potencial entre o eléctrodo de referência extracelular e intracelular do eléctrodo de medição, ou seja, o potencial da membrana da célula ^5. Com este método, Umrath feita a primeira gravação intracelular a partir de uma célula de planta, utilizando as algas Nitella ^6,7. Nitella é um organismo relativamente simples com células grandes, e portanto passíveis de experiências electrofisiologia intracelulares. Em contraste, a inserção de eléctrodos de vidro intracelular para as pequenas células de plantas terrestres, tridimensionais multi-celulares é tecnicamente exigente, requer um investigador altamente especializado, bem como a visualização sofisticado, micromanipulação, e material anti-vibração. Apesar de eletrodos de vidro são adequados para gravar a partir de células superficiais em plantas, tais como células epidérmicas raiz ^8, recordin intracelulargs de células profundamente enraizado no tecido da planta, tais como SEs, muito prováveis ​​respostas induzidas por causar danos, confundindo os resultados. Em 1989, Fromm e Eschrich relataram a utilização de um método alternativo, designado por "método pulgão ', em que eléctrodos de vidro são acoplados a estiletes afídeos após stylectomy ^4. O método pulgão é minimamente invasivo, por estiletes flexíveis não causar danos no tecido ou célula como eléctrodos de vidro fazer. Estiletes afídeos são grande invenção da natureza para a penetração planta, e pulgões são consideravelmente mais qualificados do que os seres humanos em encontrar SEs. Infelizmente, este método pulgão também é altamente exigente em termos de competências e de equipamento técnico. Além disso, o sucesso de cada experiência que implementa esta técnica depende inteiramente do pulgão estar no modo de alimentação – com o estilete estavelmente inserida num SE, no momento da stylectomy. Pensando em retrospectiva, pode-se ver que as chances de sucesso dessa técnica poderia ter sido improved adicionando à configuração experimental um instrumento que permite identificar se o estilete é pulgão na SE quando se aplica stylectomy.

Em 1964, McLean e Kinsey descrito um 'sistema de controlo electrónico "para o estudo do comportamento de alimentação de afídeos em tempo real ^9,10. Neste sistema, o pulgão da planta e penetrou-estilete foram integrados num circuito eléctrico. Mais tarde, em 1978, Tjallingii concebeu uma versão modificada do sistema, chamado sistema de 'Electrical Penetration Graph "(EPG) ^11,12. Considerando que o sistema original de monitoramento eletrônico foi sensível aos potenciais originou-resistência, apenas com o sistema EPG, a força eletromotriz (fem) originou potenciais, ou seja, gerada na planta ou no inseto, pode ser gravadas, além de potenciais decorrentes da a resistência (R) no insecto. Isto representa uma melhoria importante, porque tanto o sinal componentes, emf e R,fornecer informação biológica relevante sobre os acontecimentos durante a penetração planta por pulgões. O que torna o pré-amplificador EPG sensíveis aos R componentes é a sua relativamente baixa resistência de entrada de 1 GÊ, que é próximo da média da resistência de plantas / pulgão. Uma pequena tensão de deslocamento (Figura 1, V) de cerca de 100 mV é aplicada à planta, o qual, em seguida, é dividido entre plantas e de insectos, de um lado, e a resistência de entrada do outro. As tensões e as alterações são medidas num ponto (Figura 1A, B) entre o insecto e a resistência de entrada. Portanto, o R-componentes representam modulações de resistência de plantas pulgão da tensão de offset, enquanto os EMF-componentes são uma certa fração do potencial da planta na ponta do estilete e potenciais causados ​​no inseto. Os potenciais de plantas – mais relevantes aqui – são potenciais principalmente membrana das células vegetais perfurados por estiletes afídeos. Os potenciais de insectos parecem ser principalmentepotenciais de streaming causadas por movimentos fluidos dentro dos dois canais estilete, ou seja, a comida e os canais salivares; há potenciais nervosas ou musculares internos são registrados no EPG. Na prática, as funções de ponta de estilete como uma ponta do eletrodo. Todas as células vegetais são carregadas negativamente para dentro em relação ao exterior da célula positiva. A corrente eléctrica (isto é, o movimento de iões carregados em solução aquosa) que flui a partir do interior para o exterior e vice-versa é muito limitada devido à alta resistência da membrana celular. Normalmente, o potencial de repouso é mantida constante. No entanto, quando os iões negativos mover para fora ou iões positivos mover-se através da membrana celular, o potencial de membrana é reduzido, isto é, 'despolariza'. A despolarização ocorre no caso de excitação celular. Íons, em seguida, entrar ou sair quando os canais iónicos específicos na membrana são abertos ou quando a membrana está danificado e íons vazar dentro e para fora. Todas as células têm canais iônicos e bombas em tele membrana plasmática que trazem o potencial de membrana para o seu nível de repouso, restaurando a concentração original de vários iões dentro da célula. O potencial de repouso e as suas modificações são componentes emf, e, por conseguinte, a técnica do EPG é adequado para medi-los.

Figura 1. EPG-eletrodos. O GPE-eléctrodo é um pulgão de estar integrados no circuito eléctrico de penetração Gráfico (EPG), cuja estilete é inserido um elemento de crivo (SE) no modo de alimentação estável. Se o empalado-SE estilete está em repouso (painel A), a tensão no circuito, gravado por EPG, é estável e, ao nível de potencial de repouso (painel C, de lazer). Se o SE é animado, seus despolariza membranas (painel B), que é visualizada no EPG como um aumento gradual na voltagem (painel C, despolarização). À medida que o equilíbrio iónico no SE retorna ao descanso, ou seja, repolarizes, a tensão registrada por EPG diminui gradualmente ao resto nível potencial (Painel C, Repolarização). No painel C, "A" e "B" referem-se aos diferentes cenários apresentados nos painéis A e B, respectivamente. V = fonte de tensão compensado ajustável. Ri = resistor de entrada. Em paralelo com a resistência externa 1 GÊ, o amplificador tem uma interna (no amplificador operacional) de alta resistência de 1,5 TΩ (painéis A e B, a cinzento). Por controle remoto da chave do pré-amp EPG pode ser alterado de normal a EMF-mode, que permite a obtenção de valores de alta precisão de tensão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na próxima seção, nós fornecemos o leitor com um protocolo básico para a realização de experimentos EPG que é válido para ambos os estudos de insetos com foco e focou-planta.