El tratamiento de los productos de plaquetas con riboflavina y luz UV: Eficacia contra el alto título contaminación bacteriana
Summary
The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.
Abstract
La contaminación de las unidades de plaquetas por bacterias durante mucho tiempo ha sido reconocido como un riesgo de transfusión significativa debido a sus condiciones de almacenamiento después de la donación. Los productos se almacenan de forma rutinaria a 22 ° C en un agitador de agitación, una condición que puede promover el crecimiento bacteriano. Aunque el número total de bacterias que se cree que se introduce en un producto de plaquetas es extremadamente baja, estas bacterias pueden multiplicarse a un nivel muy alto título antes de la transfusión, potencialmente resultando en eventos adversos graves. El objetivo de este estudio fue evaluar un proceso de reducción de patógenos riboflavina basado contra un panel de bacterias que han sido identificados como contaminantes comunes de productos plaquetarios. Este panel incluye los siguientes organismos: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa y K. pneumoniae. Cada unidad de plaquetas fue inoculado con una carga bacteriana de alta y las muestras se eliminó both antes y después del tratamiento. Una formación de colonias de ensayo, utilizando un sistema de puntos de la dilución final, se utilizó para determinar los pre-tratamiento y post-tratamiento títulos bacterianas. Log reducción se calculó restando el título de post-tratamiento desde el título de pre-tratamiento. Se observaron las siguientes reducciones logarítmicas: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) y K . pneumoniae 2,8 log (99,8%). Los resultados de este estudio sugieren que el proceso podría ayudar a reducir el riesgo de eventos adversos graves transfusión asociados con la contaminación bacteriana.
Introduction
La transfusión de plaquetas, plasma, glóbulos rojos envasados y productos de sangre entera jugar un papel importante en la medicina moderna y se puede utilizar para tratar varias condiciones médicas, reemplazar los fluidos vitales y en última instancia salvar vidas. Las plaquetas son un producto celular que, o bien están aislados de la sangre entera y se agruparon en una dosis para transfusión o se recoge a través del proceso de aféresis de plaquetas. La función principal de las plaquetas en el cuerpo es para detener el sangrado en los sitios de la herida y para ayudar a mantener la hemostasia. Los pacientes que sufren de un recuento bajo de plaquetas (trombocitopenia) son susceptibles a eventos hemorrágicos espontáneos y se transfunden con plaquetas para llevar su celular recuento de plaquetas nuevamente dentro de un rango normal. Plaquetas recogidas se almacenan durante un máximo de 5-7 días y se almacenan a 22 ± 2 ° C, mientras que bajo agitación constante.
A pesar del ahorro de las propiedades de las transfusiones de plaquetas vida permanece allí un ligero riesgo para los receptores de transfusiones debido a contamination de estos productos por parásitos, bacterias y virus 11. La aplicación de las pruebas de ácido nucleico viral (NAT) ha disminuido significativamente el riesgo de transmisión viral de los principales agentes transmitidos por la sangre, como el virus de la hepatitis C (VHC), virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 5. Una publicación reciente de los Servicios de Sangre de Canadá estima que el riesgo residual de estos agentes sean 1 por 8.000.000 donaciones para el VIH, 1 por cada 6,7 millones de donaciones para el VHC y 1 por 1,7 millones de donaciones para el VHB 15.
Aunque las bacterias normalmente cosechan menos atención en el público en general, la frecuencia de contaminación bacteriana en productos de plaquetas se ha estimado para ser tan alta como 1: 1000 7 y porque millones de productos de plaquetas se transfunden cada año muchos destinatarios están expuestos a complicaciones potencialmente peligrosas para la vida como sepsis 6. La investigación sugiere que la carga bacteriana en el momentode contaminación es bajo, <100 unidades formadoras de colonias (UFC) / 2,16 de productos, sin embargo los ricos almacenamiento de medio ambiente y temperatura ambiente de nutrientes permite a las bacterias contaminantes a proliferar a peligrosamente altos títulos antes de la transfusión. En la actualidad, los métodos sólo aprobados disponibles para evitar que los productos contaminados por bacterias lleguen a un receptor de las plaquetas es a través del uso de sistemas de cultivo a base y punto de prueba rápida atención. En resumen, para sistemas de cultivo basado en productos plaquetarios se almacenan en un agitador a 22 ° C durante 12-24 horas para permitir que las bacterias proliferen en el producto, sobre el cual se extrae una muestra 4-8 ml del producto de plaquetas y se inoculó en una botella que contiene medios nutrientes. La botella se coloca en un instrumento que supervisa la botella para el crecimiento bacteriano. Si el instrumento detecta el crecimiento bacteriano en la botella que se encuentra en posición y la unidad de plaquetas correspondiente se descarta. Si bien este proceso es un éxito razonable en la detección de gro rápidoorganismos de las alas, muchas de las especies de crecimiento lento no crecen a un alto título suficiente para ser detectado, lo que crea la posibilidad de que las unidades de falsos negativos que se publicará para la transfusión 7,12,14,16,22. A diferencia de los sistemas de detección de la cultura basada, punto rápido de las pruebas de atención se realiza típicamente más adelante en el período de almacenamiento de plaquetas cuando la carga bacteriana se ha incrementado significativamente. Se requiere que los títulos superiores desde el punto de pruebas de atención son menos sensibles que los sistemas de cultivo basados, y sólo detectan de forma fiable las bacterias una vez que alcanzan un título ≥1 x 10 3 UFC / ml 17. Sin embargo este tipo de pruebas pueden proporcionar resultados dentro de 1 hora de muestreo. La variabilidad en el rendimiento de estas pruebas han dado lugar a la liberación de un producto falso negativo, causando una reacción séptico fatal en el receptor 9.
Una forma alternativa para combatir el problema de la contaminación bacteriana de los productos de plaquetas es a través del uso rutinario de un proc reducción de patógenosess que pueden inactivar bacterias contaminantes en lugar de tratar de detectarlos. El uso de riboflavina como un fotosensibilizador, en combinación con la luz UV, se ha demostrado para reducir la infectividad de una amplia gama de contaminantes transmitidos por la sangre patógenos, incluyendo bacterias 3,4,8,10,19-21 .El uso de riboflavina y UV luz para la reducción de patógenos no es tóxico y no mutagénico y componentes ligeros tratados con riboflavina y UV han demostrado ser seguros para los receptores de transfusiones, así como para las personas que manipulan productos de la sangre 18. Brevemente, las moléculas de riboflavina pueden asociar con los ácidos nucleicos (ADN y ARN) de bacterias, parásitos, virus y cualquier célula nucleada (por ejemplo, células blancas de la sangre). La exposición a la luz UV se activa riboflavina, causando una alteración química a los grupos funcionales de los ácidos nucleicos (principalmente bases de guanina), evitando así la replicación y / o transcripción de los ácidos nucleicos y dejando el organismo inactivado 13. Células anucleado como placapermite y los glóbulos rojos no se ven afectados por la química riboflavina debido a la falta de ácido nucleico.
El trabajo previo con la tecnología de riboflavina y luz ultravioleta evaluó un selecto grupo de bacterias usando un diseño experimental pretende imitar un producto de plaquetas contaminadas con una carga bacteriana clínicamente relevante (<20 UFC / producto) 8. El objetivo de este estudio fue evaluar el proceso de la luz riboflavina y rayos UV contra la contaminación bacteriana título elevado (> 1,0 x 10 5 UFC / ml) en productos de plaquetas tratadas en el plasma con el fin de medir la capacidad de reducción bacteriana total del sistema. Con base en los datos obtenidos de los estudios de hemovigilancia 1, se seleccionó un panel de que ocurren comúnmente organismos positivas negativas y gram gram para la evaluación en este estudio e incluyó las siguientes especies: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Neotomae Brucella, Bacillus cereus (forma vegetativa), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae. Todos los organismos, excepto B. cereus, se obtuvieron a partir de ATCC y se colocó en una prioridad en la obtención de cepas bacterianas que se habían identificado como estar aislado de los componentes sanguíneos. El B. cereus a prueba en este estudio es una cepa clínica aislada internamente a partir de un producto de plaquetas contaminadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detección bacteriana se ha convertido en una práctica común en las instituciones bancarias de la sangre y por muchos lugares que sirve como el principal método para evitar la transfusión de plaquetas contaminadas por bacterias. Aunque la detección de bacterias normalmente intercepta la mayoría de rápido crecimiento de bacterias Gram negativas como S. marcescens, E. coli y E. cloacae, que lucha para detectar crecimiento lento bacterias Gram positivas como S. aureus, Streptococcus spp. y S. epidermidis 8. Desafortunadamente, estas bacterias Gram positivas de tres están implicadas en más de 50% de todas las unidades de plaquetas contaminadas y la transfusión de plaquetas que contienen productos de estos tres organismos ha dado lugar a mortalidad de los pacientes 1.
Detección bacteriana se basa en el título bacteriano en un producto de plaquetas que ser lo suficientemente suficientemente alta para que al menos un organismo está contenida dentro de la muestra típica de detección 4 a 8 ml. Si el título bacteriana no es suficientemente alto para que una bacteria a ser capturado en el volumen de la muestra 4-8 ml, la unidad se encuentra en posición incorrecta como negativa y se libera para la transfusión. Un enfoque alternativo para la detección bacteriana podría ser emplear un proceso proactivo que se pueden realizar en todas las unidades de plaquetas y que podrían hacer que los organismos contaminantes como no funcional.
En este estudio, títulos elevados de bacterias se añaden intencionalmente a unidades de plaquetas para poner a prueba la capacidad total de la reducción del proceso de reducción de patógenos riboflavina y luz ultravioleta. Aunque las cargas bacterianas probadas en este estudio muy superiores a los que normalmente se encuentran en productos de la sangre en el momento de la donación, este estudio ayuda a demostrar que el proceso de riboflavina y luz ultravioleta es capaz de reducir significativamente el título de bacterias viables en una unidad de plaquetas contaminadas por 2.6 a 5.4 log (reducción de 99,7 a 99,9996% de bacterias contaminantes) (Figura 2). Para obtener una Accurate valor reducción logarítmica, es fundamental que el operador tiene buena técnica aséptica junto con las habilidades de pipeteo precisos al realizar los pasos de titulación bacterianas. Pipeteado imprecisa cuando se realizan diluciones en serie puede conducir a una acumulación de errores, por lo tanto una medición inexacta título.
Los datos recogidos en este estudio apoya el trabajo previo con riboflavina y luz UV, que desafió el sistema contra bajo nivel, bacteriemia clínicamente relevante (<20 UFC / unidad). El estudio anterior fue diseñado para imitar un evento de contaminación clínica real y los resultados mostraron riboflavina y luz UV fue eficaz para prevenir el crecimiento bacteriano durante el período de almacenamiento de plaquetas 7-día. Modelado basado en los datos del estudio anterior sugiere que las estimaciones de los riesgos actuales de contaminación bacteriana de los productos de plaquetas podrían reducirse hasta en un 98% desde los niveles actuales 8. El proceso de la luz UV riboflavina y se compara favorablemente con pantalla bacterianación, que sólo demostró una eficacia del 66% para detectar contaminantes bacterianos en las unidades de plaquetas cuando desafió con una carga bacteriana clínicamente relevante 8.
Al igual que con todas las tecnologías, el tratamiento PRT de productos plaquetarios para prevenir complicaciones asociadas con unidades de plaquetas contaminadas por bacterias tiene sus limitaciones. Sistemas PRT no son eficaces contra las esporas bacterianas y no inactivan endotoxina, por lo tanto, incluso si un sistema PRT puede inactivar títulos elevados de bacterias Gram negativas la endotoxina restante todavía puede causar shock séptico en el receptor. PRT se realiza mejor temprano durante el almacenamiento antes de que las bacterias se pueden propagar a altos títulos.
En conclusión, como se demuestra por la combinación de estos dos estudios, el proceso de riboflavina y luz UV es eficaz para reducir las cargas bacterianas de ambos organismos Gram negativas y Gram positivas y puede ofrecer una alternativa viable a la detección bacteriana. Rutinariamente treatinproductos g de plaquetas con riboflavina y luz ultravioleta también tiene el beneficio adicional de reducir la transmisión potencial de otros agentes de transmisión sanguínea como virus y parásitos.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Mirasol Illuminator | Terumo BCT | N/A | |
| Mirasol Treatment/Storage Bag | Terumo BCT | N/A | |
| Hematology Analyzer | Beckman-Coulter | Ac•T diff | |
| Blood Gas Analyzer | Siemens | RapidLab 1265 | |
| Sterile Docking Device | Terumo BCT | TSCD | |
| Platelet Incubator | Helmer | PC2200 | |
| Orbital Incubator Shaker | Lab-Line | 4628 | |
| Dry Incubator | Fisher | Iso-temp | |
| Class II A/B3 Biosafety Cabinet | Thermo-forma | 1286 | |
| Tubing Sealer | Sebra | Smart Sealer II | |
| Table Top Centrifuge | IEC | Centra GP8R | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| 30 mL Syringe | BD | 309650 | |
| 5 mL Dilution Tube | VWR | 211-0058 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 430290 | |
| Micropipette | Gilson | P-200 | |
| Micropipette | Rainin | R-200 | |
| Repeat Pipette | Eppendorf | 4780 | |
| 1-200 µL Filter Tip | Costar | 4810 | |
| 25 mL Disposable Serrological Pipette | Costar | 4489 | |
| 5 mL Disposable Serrological Pipette | Costar | 4487 | |
| 35 mL 500 µM Riboflavin | Terumo BCT | 35 mL 500 µM | |
| Brucella Agar with 5% Horse Blood | BBL | 221547 | |
| Brain Heart Infusion | Teknova | B9993 | |
| Peptone Water | BD | 257087 | |
| Trypticase Soy Broth | BD | 299113 | |
| Trypticase Soy Agar | Remel | R01917 | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050 |
Referenzen
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