Vi beskriver en metod för ex vivo maskin perfusion av humana levertransplantat vid subnormothermic temperatur (21 ° C).
There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 °C.
Levertransplantation är den enda botande behandlingen för tiotusentals patienter som lider av slutstadiet leversjukdom. För att underlätta lyckad transplantation, optimalt bevarande av levern från den tid det anskaffas från givaren tills den tidpunkt då det implanteras i mottagaren är nödvändig för att förhindra snabb försämring av transplantatet. Den nuvarande standarden för lever konservering kallas "statisk kylförvaring ': levern kyls i en iskall konservering lösning, vilket minskar metabolismen av levern och bromsa de skadliga effekterna av ischemi. Även om denna kylförvaring teknik har möjliggjort lyckad transplantation, organ marginell kvalitet såsom DCD organ skadats av varm ischemi eller steatos show sämre behandlingsresultat 1. Det är ett snabbt växande mängd bevis som ex vivo maskin perfusion av levertransplantat som alternativ konservering modalitet kan potentiellt imbevisar utfall för dessa marginella organ 2,3.
Levertransplantation har blivit ett offer för sin egen framgång. Långt fler patienter remitteras för transplantation än det finns lever tillgängliga och tusentals dör på väntelistan i USA varje år. Med tanke på den verklighet givarleverbristen och den ökande användningen av levertransplantat av suboptimal kvalitet för behövande mottagare, är det allmänt ansett att ex vivo maskin perfusion av levertransplantat före implantation håller löftet om ett paradigmskifte i levertransplantation. Det har skett en markant ökning av intresset forskningen i detta ämne under de senaste åren 4-8. I flera europeiska och nordamerikanska centra hypotermi maskin perfusion har gjort en klinisk introduktion 8 och normotermisk maskin perfusion vid fysiologiska temperaturer har nyligen tillämpats på kasse mänskliga levrar och översätts till klinisk användning samt 9.Omfattande utveckling har lett till utvecklingen av olika protokoll, medan kontinuerlig optimering identifierar den optimala perfusion Parametrar 10-12. Användning av marginell kvalitet transplantat har ökat mer än 10 gånger under det senaste årtiondet 13. Jämfört med den nuvarande standarden för lever konservering (statisk kylförvaring), ger ex vivo maskin perfusion många potentiella fördelar, som alla leder till välbehövlig utbyggnad av organpoolen och en potentiellt minskning i incidensen av posttransplantationskomplikationer. I synnerhet de gallvägarna komplikationer som för närvarande plågar levertransplantat suboptimal kvalitet efter transplantation förbli en betydande fråga 14-18.
Maskin perfusion vid subnormothermic förhållanden ger ett tidsfönster för att bedöma transplantatfunktion objektivt som till lämplighet för transplantation 19. Medan levern är perfusion i en ex vivo krets, både perfusatet and gallan som produceras under perfusion kan provtas för mätning av markörer för organfunktion. På detta sätt "allvarligt äventyras" lever som kastas för transplantation enligt de nuvarande kriterierna objektivt kan bedömas med avseende på deras lämplighet för transplantation. Viabiliteten bedömning potentiellt medger många av dessa organ för att utnyttjas för transplantation. En lika kraftfull fördel med maskin perfusion är reparation och förbättring av levrar som har skadats av varm / kall ischemi. ATP utarmas mycket snabbt under varma och efterföljande kall ischemi och kan repleted under en period av maskin perfusion före implantation av levern 20. Levern, med sina energiaffärer och metabola tillstånd fyllas, är konditioneras och bättre förberedda för de skadliga verkningarna av reperfusionsskada efter implantation i mottagaren.
Detta arbete beskriver en metod för ex vivo maskin perfusion av human lever grafts i laboratoriet, vilket kommer att vara till nytta för forskare som vill studera både tekniken och positiva effekter av ex vivo maskin perfusion. Vi använder oss av humana donator lever som har minskat för transplantation och därefter tilldelats för forskningsändamål.
Standardlever upphandling teknik innebär på plats arteriell spola av levern efter aortatvärkläm i hjärndöda donatorer (DBD) eller efter cirkulationsstillestånd i cirkulationsdöds donatorer (DCD), som beskrivs mer i detalj på annan plats 20. Dessutom är levern kyls under upphandlingen genom att fylla givarens bukhålan med is. Spola lösning preferenser varierar mellan regionerna, med majoriteten av upphandlingar med hjälp av University of Wisconsin eller histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK) lösning. En extra back-tabellen flush av portalen ven förbättrar washout av resterande blod. Lever ofta upphandlas lämnar en aortasegment suravrundning celiaki stammen. Gallblåsan är snittas, galla sugs och gallgången spolas. Lever är förpackade i sterila påsar innehållande iskall konservering lösning och transporteras i utsedda lådor eller kylare. För representativa resultat varm och kall ischemi tid bör begränsas till 60 minuter och 12 timmar, respektive. Trots rutin serologisk screening för överförbara patogener, måste standard försiktighetsåtgärder vidtas vid överlämnandet mänskliga organ, prover från mänskliga organ, och restprodukter.
Protokollet här beskriver subnormothermic maskin perfusion med ett kommersiellt tillgängligt leverperfusion enhet. Användning av en sådan anordning möjliggör snabbare översättning till den kliniska inställningen och kors validering av olika protokoll och enhetsinställningar bland forskargrupper och transplantationscentra.
I ett försök att återvinna levrar skadade under ischemi utvecklade vi ett SNMP-system som kan användas efter en period av kylförvaring. Subnormothermic maskin perfusion erbjuder ett lönsamt alternativ till konventionell kylförvaring, samt hypotermiska och normotermisk maskin perfusion modaliteter. Existerar Olika olika system; alla erbjuder olika fördelar och nackdelar 3,9,20. SNMP möjliggör perfusion utan en syrebärare, som metaboliska syrekrav på 21 ° C möts av aktivt syresättning av perfusatet.
Även reduceras under subnormothermic förhållanden, är ämnesomsättningen betydande och kräver stöd av en näringsrik perfusion lösning. Traditionella perfusionslösningar, såsom Belzer maskin perfusionslösningen, är i allmänhet minimal i sammansättning och är avsedda för kall perfusion. Williams Medium E har använts som en hepatocyt odlingsmedium under många år, och innehåller components som är universella för att stödja cellulär funktion, särskilt under varma ex vivo förhållanden.
Mätningar som gjorts under maskin perfusion är reflekterande av funktionen av organet. Direkt observer parametrar såsom galla produktion och syreupptagning är realtidsmätningar som kan användas för att bedöma lever pre-transplantation. På samma sätt kan markörer för cellskada och ischemi (K +, laktat release) mätas direkt i perfusion lösningen och kan tyda på organfunktion 20. Som maskin perfusion teknik utvecklas ytterligare och uppnår mer utbredd klinisk tillämpning, kan korrekta korrelationer mellan ex vivo funktion och kliniskt utfall göras och perfusion parametrar kommer att vara till nytta i att bistå beslut att transplantera eller avvisa marginell kvalitet lever. Dessutom som punkt-vård analysverktyg förväg, kommer mer sofistikerad analys blir tillgängliga direkt under maskinen perfusionen 21.
I detta arbete visar vi att lever kan stödjas i SNMP-system med minimal skada på levern, reflekteras av histologi och frisättning av ALAT. Funktionell återhämtning av levern bäst reflekteras av ATP, vilket har visat sig korrelera till lever livskraft och är starkt tyder på transplantation framgång i djurmodeller 22. Ex vivo och pre-transplantation återhämtning av levertransplantat skulle tillåta en betydande expansion av givaren lever pool, korrigera skillnaden mellan utbud och efterfrågan på givar levrar vid transplantation.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering från amerikanska National Institutes of Health (beviljar R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 och F32 DK103500), CIMIT Projekt nr 12-1732 och Shriners sjukhus för barn är tack erkänt. Vi vill tacksamt erkänna New England Organ banken för att stödja detta arbete.
Liver Assist perfusion device | Organ Assist B.V. | Liver Assist | |
Liver Assist disposable set | Organ Assist B.V. | Liver Assist disposable | |
Williams’ Medium E | Sigma | W1878–6x500ml | |
Insulin | Eli Lilly & Co | Humulin R U-100 | |
Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml | Life Technologies | 15070-063 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-156 | |
Hydrocortisone | MGH pharmacy | 7750500 | |
Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2 | Airgas | ZO2OX9522000043 | |
Specialty gas regulator | Airgas | Y11244D580 | |
Lactated Ringer’s solution | Baxter | 2B2324X | |
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | 316-155 | |
Toothed Adson forceps | Roboz | RS-5234 | |
Debakey tissue forceps, 7.75”, 2.25 mm | Roboz | RS-7562 | |
Metzenbaum Scissors 7" Curved SureCut Tungsten | Roboz | RS-6965SC | |
Castroviejo Needle holder 5.5–7” | Fine Science Tools | 12565-14 | |
0 blackbraided silk sutures | Ethicon | SA66G | |
4-0 nylon suture, Nurolon RB1 | Ethicon | C554D | |
Blood gas analysis machine | Siemens | RapidPoint 500 | |
Balance scale | Cole Parmer | EW-10000-12 | |
Pressure display box | Medtronic | 66000 | |
Disposable pressure display sets | Medtronic | 61000 | |
Handheld thermocouple thermometer and probe | Cole Parmer | EW-91500-04 and EW-08516-55 | |
Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm | Medtronic | 30005 | |
Irrigation set flush tubing | Hospira | 06543-01 | |
Mixing bowl, 4L | Cole Parmer | EW-07300-40 |