Nous décrivons une méthode ex vivo machine à perfusion de greffes de foie humain à la température subnormothermic (21 ° C).
There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 °C.
La transplantation hépatique est le seul traitement curatif pour des dizaines de milliers de patients qui souffrent de maladies du foie en phase terminale. Pour faciliter une transplantation réussie, une conservation optimale du foie à partir du moment qu'il est obtenu à partir du donneur jusqu'au moment où il est implanté chez le receveur est nécessaire pour éviter une détérioration rapide de la greffe. La norme actuelle pour la conservation du foie est appelé «stockage à froid statique": le foie est refroidi dans une solution de conservation glacée, ce qui réduit le métabolisme du foie et de ralentir les effets délétères de l'ischémie. Bien que cette technique de stockage à froid a permis de transplantation réussie, organes de qualité marginale tels que les organes DCD endommagés par l'ischémie chaude ou stéatose spectacle patients inférieure résultats 1. Il ya un corps en pleine expansion de la preuve que l'ex vivo machine à perfusion de greffes du foie comme la préservation modalité alternatives peuvent potentiellement improuver résultats pour ces organes marginaux 2,3.
La transplantation hépatique est devenu victime de son propre succès. Beaucoup plus de patients sont référés à la transplantation de foie il ya disponibles, et des milliers meurent sur la liste d'attente aux États-Unis chaque année. Compte tenu de la réalité de la pénurie de foie de donneurs et de l'utilisation croissante des greffes de foie de qualité optimale pour les bénéficiaires nécessiteux, il est largement admis que ex vivo machine à perfusion de greffes de foie avant l'implantation détient la promesse d'un changement de paradigme dans la transplantation du foie. Il ya eu une augmentation marquée de l'intérêt de la recherche dans ce sujet au cours des dernières années 4-8. Dans divers centres européens et nord-américains la machine hypothermie perfusion a fait une introduction 8 et normothermique machine à perfusion clinique à des températures physiologiques a été récemment appliquée à foies humains mis au rebut et est en cours de traduction à l'utilisation clinique ainsi neuf.Le développement intensif a conduit à l'élaboration de divers protocoles, tandis que l'optimisation continue identifie la perfusion optimale paramètres 10-12. Utilisation de greffons de qualité marginale a augmenté de plus de 10 fois au cours de la dernière décennie 13. En comparaison avec la norme actuelle pour la préservation du foie (de stockage à froid statique), ex vivo machine à perfusion offre de nombreux avantages potentiels, qui résultent toutes de l'expansion tant besoin de la piscine d'organes et une baisse potentiellement l'incidence des complications post-transplantation. En particulier, les complications biliaires qui affligent actuellement greffes de foie optimale de qualité après la transplantation restent une question substantielle 14-18.
perfusion de la machine dans des conditions subnormothermic fournit une fenêtre de temps pour évaluer la fonction du greffon objective quant à la convenance pour la transplantation 19. Bien que le foie est perfusé dans un circuit ex vivo, à la fois un perfusate la bile produite pendant la perfusion peut être échantillonné pour la mesure des marqueurs de la fonction d'organe. De cette façon, «gravement compromis» foies qui sont jetés à la transplantation dans les critères actuels peuvent être objectivement évaluées quant à leur aptitude à la transplantation. évaluation de la viabilité permet potentiellement de plusieurs de ces organes à être utilisés pour la transplantation. Un avantage tout aussi puissant de la machine perfusion est la réparation et l'amélioration des foies qui ont été endommagés par l'ischémie chaude / froide. ATP est épuisée très rapidement au cours de l'ischémie chaude et froide et subséquent peut être repleted pendant une période de machine à perfusion avant l'implantation du foie 20. Le foie, avec ses réserves d'énergie et l'état métabolique reconstitué, est un préconditionnement et être mieux préparés pour les effets dommageables des lésions de reperfusion après implantation chez le receveur.
Ce travail décrit une méthode de perfusion ex vivo la machine de graf de foie humaints dans le laboratoire, qui sera utile pour les chercheurs qui souhaitent étudier à la fois la technique et les effets bénéfiques de l'ex vivo machine à perfusion. Nous faisons usage de foies de donneurs humains qui ont été refusées pour la transplantation et sont ensuite attribués à des fins de recherche.
Norme technique de passation des marchés du foie consiste à fleur artérielle situ du foie après clampage aortique dans le cerveau donneurs décédés (DBD) ou après un arrêt circulatoire chez les donneurs de mort circulatoires (DCD), décrites plus en détail ailleurs 20. En outre, le foie est refroidi lors de la passation en remplissant la cavité abdominale du donneur avec de la glace. Préférences de solution de rinçage varient entre les régions, la majorité des achats à l'aide de l'Université du Wisconsin ou histidine-tryptophane-cétoglutarate (HTK) solution. Un retour table de rinçage supplémentaire de la veine porte améliore le lessivage de sang résiduel. Livers sont souvent achetés en laissant un segment sur aortiquearrondissant le tronc cœliaque. La vésicule biliaire est incisée, la bile est aspiré, et le canal biliaire est rincé. Les foies sont emballés dans des sacs stériles contenant une solution de conservation glacée et transportés dans des caisses ou des refroidisseurs désignés. Pour obtenir des résultats représentatifs temps d'ischémie chaude et froide doit être limitée à 60 min et 12 h, respectivement. Malgré le dépistage sérologique de routine pour les agents pathogènes transmissibles, les précautions standard doivent être prises lors de la remise des organes humains, des échantillons obtenus à partir d'organes humains, et tous les produits de déchets.
Le protocole décrit ici subnormothermic perfusion de la machine en utilisant un dispositif de perfusion de foie disponible dans le commerce. Utilisation d'un tel dispositif permet plus de traduction rapide à la clinique et la validation croisée de différents protocoles et paramètres de l'appareil parmi les groupes de recherche et des centres de transplantation.
Dans une tentative pour récupérer le foie blessés pendant l'ischémie nous avons développé un système de SNMP qui peut être utilisé après une période de stockage de froid. Subnormothermic machine à perfusion offre une alternative viable au stockage à froid classique, ainsi que les modalités machine à perfusion d'hypothermie et normothermiques. Divers systèmes différents existent; tous offrent différents avantages et inconvénients 3,9,20. SNMP permet une perfusion sans un transporteur d'oxygène, comme les demandes métaboliques de l'oxygène à 21 ° C sont satisfaits par l'oxygénation active de la perfusion.
Bien que réduite dans des conditions subnormothermic, le métabolisme est important et nécessite le soutien d'une solution de perfusion riche en éléments nutritifs. Solutions pour perfusions traditionnels, tels que la solution de perfusion appareil Belzer, sont généralement minimes dans la composition et sont conçus pour perfusion froid. Moyen E de Williams a été utilisé comme milieu de culture d'hépatocytes pendant de nombreuses années, et contient des composantes qui sont universels pour soutenir la fonction cellulaire, en particulier des conditions ex vivo chaudes.
Les mesures effectuées au cours de la perfusion appareil sont le reflet de la fonction de l'organe. Paramètres directement observables telles que la production de bile et la consommation d'oxygène sont des mesures en temps réel qui peuvent être utilisés pour évaluer le foie pré-transplantation. De même, les marqueurs de lésions cellulaires et l'ischémie (K +, la libération de lactate) peuvent être mesurés directement dans la solution de perfusion et peuvent être le signe de la fonction des organes 20. Comme la technologie machine à perfusion développe davantage et réalise l'application clinique plus répandue, des corrélations précises entre ex vivo la fonction et les résultats cliniques peuvent être faites et les paramètres de perfusion seront utiles en aidant les décisions de transplantation ou rejeter foies de qualité marginale. En outre, comme point de soins outils analytiques avance, une analyse plus sophistiquée sera disponible directement lors de la machine perfusion 21.
Dans ce travail, nous montrons que le foie peuvent être pris en charge dans le système SNMP avec des blessures minimes au foie, réfléchie par l'histologie et la libération de ALT. La récupération fonctionnelle du foie est mieux reflétée par l'ATP, qui se est révélé être en corrélation à la viabilité du foie et suggère fortement du succès de la transplantation chez des modèles animaux 22. Ex vivo et la récupération pré-transplantation de greffons de foie permettrait une expansion importante du donneur piscine du foie, la correction de la disparité entre l'offre et la demande de foies de donneurs en transplantation.
The authors have nothing to disclose.
Financement des Instituts nationaux américains de la santé (accorde R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 et F32 DK103500), n ° 12-1732 CIMIT projet et les Hôpitaux Shriners pour enfants est appréciée. Nous tenons à remercier la Banque de la Nouvelle Angleterre Organe pour soutenir ce travail.
Liver Assist perfusion device | Organ Assist B.V. | Liver Assist | |
Liver Assist disposable set | Organ Assist B.V. | Liver Assist disposable | |
Williams’ Medium E | Sigma | W1878–6x500ml | |
Insulin | Eli Lilly & Co | Humulin R U-100 | |
Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml | Life Technologies | 15070-063 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-156 | |
Hydrocortisone | MGH pharmacy | 7750500 | |
Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2 | Airgas | ZO2OX9522000043 | |
Specialty gas regulator | Airgas | Y11244D580 | |
Lactated Ringer’s solution | Baxter | 2B2324X | |
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | 316-155 | |
Toothed Adson forceps | Roboz | RS-5234 | |
Debakey tissue forceps, 7.75”, 2.25 mm | Roboz | RS-7562 | |
Metzenbaum Scissors 7" Curved SureCut Tungsten | Roboz | RS-6965SC | |
Castroviejo Needle holder 5.5–7” | Fine Science Tools | 12565-14 | |
0 blackbraided silk sutures | Ethicon | SA66G | |
4-0 nylon suture, Nurolon RB1 | Ethicon | C554D | |
Blood gas analysis machine | Siemens | RapidPoint 500 | |
Balance scale | Cole Parmer | EW-10000-12 | |
Pressure display box | Medtronic | 66000 | |
Disposable pressure display sets | Medtronic | 61000 | |
Handheld thermocouple thermometer and probe | Cole Parmer | EW-91500-04 and EW-08516-55 | |
Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm | Medtronic | 30005 | |
Irrigation set flush tubing | Hospira | 06543-01 | |
Mixing bowl, 4L | Cole Parmer | EW-07300-40 |