The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.
在多能干细胞培养持续进步是,使得收盘板凳和床头之间的差距在再生医学,药物发现和安全测试使用这些细胞。为了生产干细胞衍生的生物药剂和细胞组织工程和移植,具有成本效益的电池制造技术是必不可少的。多能性和性能细胞的下游应用( 例如 ,细胞分化),随着时间的推移稳定的维护是极为重要的大型电池生产。然而,这可能难以实现,特别是如果细胞是手动培养,其中操作者可以引入显著变性以及非常昂贵按比例扩大。要使用台式多通道液体处理机器人所开发的需要最少的技术人员参与或经验,使高通量,大规模的干细胞生产和删除操作人员的影响新型干细胞培养协议。同这些协议的诱导的人多能干细胞(iPS细胞)是在无饲养条件下培养,直接从冷冻的储存,并保持在96孔板中。取决于细胞系和所希望的放大比率时,操作者能够方便的时候通过基于一系列图像,显示的最优菌落密度为分裂的确定。那么必要的试剂准备进行拆分殖民地新板不离心步骤。后20通道(〜3个月),两个iPSC系保持稳定的核型,表达干细胞标记物,并分化成具有高效率的心肌细胞。该系统可以执行的设计用于96孔板新分化的协议或遗传操作随后的高通量筛选。这项技术将减少劳动力和技术负担,产生大量相同的干细胞为无数的应用。
6 –利用人体诱导多能干细胞(iPS细胞)的已显著,因为它们的推导在2007年1化合物测试,再生医学和疾病建模2增加。这种需求来自iPSC的的能力,以产生大量的多能干细胞,它可以在一个无与伦比的数量分化成体细胞。作为定向分化技术提高7 – 10和人体细胞或组织建模和细胞疗法的发展增加了11 – 14,所以确实为大量生产高品质的iPSC的要求。它被广泛引用,其它的疾病中,心肌梗塞或B细胞功能替代将需要数亿至数十亿的iPSC衍生的体细胞15 – 18。此外,日益复杂的3D建模组织对药物发现和Therapy将需要大量的细胞9,13,19的。在所有这些例子中,所定义的均匀和可再现的iPSC必须提供和直接产生。
为了生产干细胞衍生的生物药剂和细胞组织工程和移植,具有成本效益的电池制造技术是必不可少的。规模化生产iPS细胞都集中在悬浮培养20 – 25或中止与使用微载体基板26 – 28部分是因为这些技术成功地部署了大规模,非IPSC的,真核为主的生产。一些研究小组已经证实,得到的多能干细胞20,21,23,24,29悬浮培养系统。然而,这些方法利用不容易获得的研究人员开发新的分化方案昂贵且复杂的系统,驾驶组织工程和操作的实验室及其他实验室ORY规模的研究。此外,悬浮液和微载体的iPSC培养需要适应和技术或传统的贴壁的iPSC培养未发现的化学物质,如连续使用Rho激酶抑制剂,消泡剂和过滤来调节聚合。物理应力的细胞是在悬浮培养更为普遍,通过机械搅拌以及微载体碰撞过程中引入的。这些问题限制了可预测性和速度,新产生的干细胞系可以在悬浮液中培养。其他已开发出模仿板培养技术30,31机器人板处理系统,但这些平台需要显著用于投资的设备和专业技术除了具有干细胞培养相关的基本挑战进行操作。
下面的工作说明了发展和一个可伸缩的iPSC培养系统的实践,利用一个自包含的,标准的8通道机器人液体处理程序和96孔板中。这种方法旨在弥合实验室规模的iPSC文化和高容量的iPSC生产( 如 10 7 – 1.5×10 9细胞每周每个技术人员),使那些开发新的iPSC技术,轻松扩大生产没有大的硬件或劳务的投资。这种方法是相对便宜的设置,需要很少或没有干细胞培养,编程或工程经验,具有小的设备占地面积,而不需要专门的细胞培养罩,并利用标准的细胞培养设备,以使介质自动化高吞吐量电池生产。这样做的目的是开发能够可以通过实验室新的干细胞培养可以利用可扩展的干细胞培养体系,那些谁找到人工栽培的障碍,以发展自己的想法或那些想要一种经济手段,产生大量的干细胞。这里介绍的平台上删除技术的影响干细胞培养和标准化饲养通道程序,使一致的干细胞生产。
在本研究中,我们开发了机器人文化的一部分,小型化和自动化饲养和通路在96孔板形式,同时也使有效规模起来的方法的iPSC生产。液体处理机器人被用来喂常规殖民地的iPSC和通过他们定期通过酶解。机器人还编程以产生细胞外基质凝胶包被的板并执行接种密度梯度。当成纤维细胞和脂肪来源的iPS细胞进行培养在本系统中为大于20代,约3个月,多能性维持,因为是稳定的核型。两种细胞系都能够分化成心肌细胞。一起,协议的这里所描述的集使用户用很少的干细胞培养的经验,或限制访问专门培养设备,培养的干细胞,并实现高电池产量或多行处理以最小的劳动和成本。
<p class ="“jove_content”">这里详细介绍的机器人协议为IPSC的生产和加工的经济规模了一个方法。一个优点是在建立基于板形式展示在这里可扩展的干细胞培养和以前44,47 – 49保持多能性。而其他格式可扩展的干细胞培养的产量多能干细胞的20,23,29基于这种盘法,需要在文化本质的格式没有变化,就像适应停牌,使用消泡剂化学物质或长时间使用Rho激酶抑制剂20的。这种基于板的方法可以快速,因此,可预见的和,适应新的生产线,因为培养条件是相似的。由于使用iPS细胞用于疾病建模增加4,6,19,50,新的iPSC系不断产生。此处所描述的技术是最适合培养的新线在中到高容量和吞吐量,因为阻挡过渡到格式是升流。这也是真正的劳动和必要维持菌落设备。最后,因为格式和处理类似于用于推导和验证iPSC系,培养的性能,如定向分化的环境中,很可能是更可预测。图8示出一种策略为干细胞的生产在96孔板向上扩展。一个板(周期0)用于机器人种子12的新板,一个12倍的增加(周期0到1)。后馈送的几天,十二板之一是传代种子的另一组12板(周期1到周期2)。剩余的11板是现在可用于其它用途,并代表该系统的生产成分。按照这个速度,一个板通道将提供11个板每个周期,或每3-4天。这种方法可以按比例更当多个板传代中所示的过渡从周期2到周期3在周期3,两个板都始终用来维持殖民地种子24个新盘。其余22板然后可对每个通道循环后使用。在维护周期的任何一点,用户可以种子多个板,以提高产量。一个例子是将通道的每一列两个生长周期。第一通道转换一个板成12片,并且每个12板被用于接种144板。在这种情况下,一个用户启动与一个板和两个通道,或约1.5-2周的培养之后,有144个板。例如,成纤维细胞和脂肪iPSC系产生每96孔板约25-75万个细胞时,准备通过。因此,144板可以代表约4-7×10 9细胞。
这是用于实现144 96孔板机器人的劳动负担?一对这项工作的目标是可扩展的干细胞的生产是降低了劳动相比传统( 即 ,6孔板)干细胞培养物。该机器人ACComplishes这通过减少需要饲养和传代过程中,物理处理每个板。而96孔板生产规模直线状,将在传统的6孔板中,技术人员花费与板的工作时间是显著较少使用机器人培养。机器人培养的生产效率是从该差值( 图9)导出。它被发现的技术人员可以从培养箱取出一个6孔板,检查它在显微镜,然后吸和饲料盘在约3.5分钟。相比较而言,技术人员花费约30秒除去96孔板从保温箱,并把它放在机器人之前在显微镜对密度和污染检查它。类似于上面所描述的扩展的馈送协议,六96孔板可以加载和进食,这需要大约21分钟,或每板3.5分钟。总的运行时间养活板相媲美的机器人之间IC和手动的方法,但要亲手喂6板技术人员需要的是所有21分钟,而技术人员只花费3分钟处理六大板块为机器人(每板30秒检查)。如图9所示,一个技术人员花费处理144板使用机器人的时间大约是1.2小时作为手动反对8小时,机器人将从来不会出错处理板或转移液体。
这里所描述的96孔的iPSC培养方法提供复杂的筛选任务的易于处理的平台。因为每个孔是遗传上相同,并接种在从相同的初始池相同的密度,可以将变量分布在板,并通过与市售的储层偏析条件机器人保持。这对于实验如干细胞生长培养基发育34,35,47,衬底或培养条件的测试和利用干细胞的毒性研究中是有用51。由于每个干细胞系是在最佳菌落大小和通道的要求而言唯一的,人们可以使用该系统通过操纵收获的列,通过期间的机械搅拌和进给频率调制接种密度,喂食次数通路的处理。通过这些变量的集合将会允许用户快速找到一套适合新行的培养条件或开发新的养殖技术。该机器人系统还能够保持96平行的,但独立的干细胞集落。当的iPSC衍生自体细胞或遗传操作之后克隆,许多平行的克隆进行筛选,以产生潜在iPSC系。一旦单个细胞接种到96孔板中,该系统可以进给和通道中的96孔板保持各菌落分离。这使得高产量潜力选择时,克隆并消除身体中培养96平行线的难度。这种方法也有llows扩大了生产的每一个克隆的,这样的材料很容易为平行分析。最后,我们设想结合用机器人板贩卖系统,可提供板到和从培养箱能够完全自动化培养这些培养技术。这可以实现更复杂的机器人,其允许更大的扩展,因为此处描述的基本协议转移到其它板的系统。
在协议地址的第一个关键步骤是那些防止和检查污染,如步骤1.5和4.2。污染,如上面所讨论的,可以成功地如果良好的无菌技术和常识被利用避免。它是必要的,无论干细胞培养的格式,即在指定的步骤的操作员检查污染和在这个协议中这样做将显著降低污染的风险。合适的细胞外基质凝胶申请是第二ESS的无穷区间步此协议的全面成功。没有适当涂覆的96孔板中,干细胞不会生长。一个常见的问题是不完整以及涂层。经验表明,气泡,静电引力和毛细作用阻碍完整良好的涂层。预润湿步骤(1.6)的开发是为了显著改善井底部涂层和不应该被跳过。该预湿润步骤出现减少的塑料96孔板的表观疏水使得当外基质凝胶涂层施加它被均匀地分布在井底部和侧面。此外,还建议轻轻敲击与干净的手涂一次,以保证均匀的细胞外基质凝胶溶液分布96孔板。解离的参数也很重要,以优化。用酶或EDTA基于解离试剂延长孵育将导致单个细胞可以或可以不通过期间的目标。因此,操作者应特别注意解离时间,研磨力,洗净重复是如何影响菌落形态和健康,并相应地调整。
理解的局限在这里所描述的技术是极为重要的操作成功。如在任何其他的细胞培养环境,使用96孔板的呈现一个相对高的污染的风险。如上所述,技术人员是饲养期间和传代处理每一板;例如,当打开盖子,把该板在机器人上的床,并检查板在显微镜。因此,步骤后1.5如前所述,当务之急是不要触摸任何板盖内或暴露这个部分的任何可能被污染的表面,如倾斜的加热块或垂直销在床上。在协议开发这一限制被发现,是推动制定一个机架容纳板盖保持无菌。同样,槽水库,枪头和邻疗法用品上的液体处理机器人床是潜在的污染源,因为它们是开放的环境以及由技术员处理。因此,良好的无菌技术应该被应用,如减少运动曝光过度培养材料或打开液体。另一个限制是,当协议被放大,目视确认的“100 96孔板每孔是麻烦的。这可通过视觉检查整个板污染的迹象,如混浊介质进行处理,以识别可疑的孔中。对于未来的规模时,使用自动显微镜和细胞生长和潜在的污染的指标将被引入。
总之,这里所描述的高通量的96孔平台提供了一个可重复的,高保真用于干细胞培养和生产的板形式的方法。这种方法减少了必要的经验,致力于干细胞培养,而设备和必要的劳动时间保持传统贴壁培养的好处。
The authors have nothing to disclose.
这项工作已部分由美国国立卫生研究院资助,R44 GM087784和R01 HL109505的支持。作者感谢的技术和OEM团队吉尔森,INC延长的技术支持。
96-well plates | Corning | 3596 | 96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped |
Seahorse Trough | SeahorseBio | 201308-100 | Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs |
Gilson Tips | Gilson | F167023 | 10 racks gilson 96tips D200 tips |
DMEM/F12 | Life Technologies | 12500062 | DMEM/F12 powder. Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter. |
Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 354230 | Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 mL |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 5857 | mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance. |
E8 Media | StemCell Technologies | 5940 | TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance |
Y27632 | AdooQ BioScience | A11001-50 | Rock inhinitor Y-27632 2HCI |
Accutase | Innovative Cell Technologies | ACCUTASE | Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 mL sterile cell solution |
PBS | Fisher | SH30256FS | PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk |
Gilson PIPETMAX | Gilson | PIPETMAX | http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk |