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Medizin

De alta frequência Ecografia de mouse linfonodos cervicais

Published: July 25, 2015
doi:
10.3791/52718
, ,
1Department of Neurobiology and Anatomy,West Virginia University, 2Animal Models and Imaging Facility,West Virginia University, 3Mary Babb Randolph Cancer Center,West Virginia University

Summary

Este protocolo descreve a aplicação de ultra-som de alta freqüência (HFUS) para rato imaging linfonodos cervicais. Esta técnica otimiza a visualização e quantificação da morfologia cervical linfonodo, volume e fluxo sanguíneo. Biópsia de linfonodos cervicais e processamento de tecido linfático para avaliação histológica guiada por imagem também é demonstrada.

Abstract

De alta freqüência ultra-som (HFUS) é amplamente utilizado como um método não-invasivo para a imagem latente estruturas anatômicas internas em sistemas de pequenos animais experimentais. HFUS tem a capacidade de detectar estruturas tão pequenas quanto 30 um, uma propriedade que tem sido utilizada para visualizar linfonodos superficiais em roedores em brilho (B) -modo. Combinando o poder com Doppler em modo-B permite medir o fluxo sanguíneo circulatório dentro de nódulos linfáticos e outros órgãos. Enquanto HFUS tem sido utilizada para imagiologia do nó de linfa de um número de sistemas de modelos de rato, não foi relatado um protocolo detalhado descrevendo imagiologia HFUS e caracterização dos nódulos linfáticos cervicais em ratinhos. Aqui, mostramos que HFUS pode ser adaptado para detectar e caracterizar nódulos linfáticos cervicais em ratinhos. B-modo combinado e Doppler poder pode ser usado para detectar aumentos no fluxo sanguíneo nos gânglios cervicais imunologicamente ampliadas. Nós também descrevem o uso de em modo-B para realizar biópsias por agulha fina de linfa cervical nãodes para recuperar tecido linfático para análise histológica. Finalmente, passos-aided software são descritos para calcular as variações de volume dos linfonodos e visualizar alterações na morfologia dos linfonodos seguintes reconstrução da imagem. A capacidade de monitorar visualmente alterações na biologia nódulo linfático cervical ao longo do tempo proporciona uma técnica simples e poderosa para a monitorização não invasiva das alterações dos nódulos linfáticos cervicais em modelos pré-clínicos de rato da doença da cavidade oral.

Introduction

Drenagem linfática do tecido fluido intersticial é o principal método de difusão para microorganismos infecciosos e cancros resultantes na região oral e maxilofacial 1,2. A avaliação clínica dos nódulos linfáticos cervicais é uma prática comum de diagnóstico para determinar a presença ou progressão de doenças que se originam na cavidade oral. Isso ressalta a importância dos linfonodos cervicais da coleta em locais anatômicos valiosas para o diagnóstico da doença por via oral 3. Diversas metodologias de imagiologia especializados são clinicamente utilizada para a identificação de linfonodos cervicais doentes. Estes incluem a tomografia de emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada (TC) e ressonância magnética (RM). Embora altamente valiosos, estes métodos requerem todos extensa preparação do paciente, equipamentos altamente especializados e / ou infusão química para a circulação para habilitar ou aprimorar o processo de imagem.

Sonográfica (ultra-som; US) é uma técnica comumente aplicado usadas para imlinfonodos cervicais em geral apresentam com linfadenopatia devido à infecção ou comprometimento metastático 4-6. EUA é muitas vezes combinado com PET-CT e ressonância magnética para fornecer uma representação completa do estado do linfonodo paciente, ajudando a determinar o estadiamento do tumor ea necessidade de excisão cirúrgica 7. A natureza não-invasivo de nós também tem vantagens inerentes sobre outras modalidades de imagem, incluindo a facilidade de utilização, baixo custo, o mínimo de desconforto do paciente e preparação. A localização subcutânea superficial da maioria dos linfonodos cervicais permite a US para guiar biópsias aspirativa por agulha fina minimamente invasivas com maior precisão, melhorando a precisão do diagnóstico 8.

De alta freqüência comercial (IC) dos EUA fornece resolução detalhada de estruturas anatômicas internas a 30 um 9. Utilizando transdutores variando 22-70 MHz, HFUS foi prontamente aplicadas a uma variedade de sistemas de roedores experimentais para permitir a imagiologia em tempo real dos órgãos internos in vivo.; HFUS foi adaptado para a visualização da formação de tumor em brilho (B) -modo convencional, bem como com um número de gerais e especializados agents9 realce do contraste. Usando Doppler poder com HFUS fornece a capacidade de monitorar o fluxo de sangue dentro de tumores de ratos, permitindo uma avaliação abrangente da perfusão angiogênico em camundongos vivos 10,11. HFUS tem sido usada para visualizar os nódulos linfáticos do rato doentes dentro da cavidade do corpo principal, demonstrando utilidade paralelo desta tecnologia para a prática clínica. Em particular, inflamatórias e metastáticos alterações linfonodos visceral têm sido observados em modelos de ratos com câncer de mama abrigando 12,13, 14 de pâncreas, colo-retal e pulmão 15 16 tumores, bem como histocytomas fibrosos 17, e um modelo de rato de idade hydronephrosis adquiriu 18 . Estes exemplos solidificar o valor de HFUS como uma poderosa ferramenta de investigação de linfadenopatia induzida por tumor em uma ampla variedade de rosistemas de dente.

Vários modelos de infecção bacteriana 19,20 e cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermóide) 21,22 foram desenvolvidos para estudar estas doenças na configuração pré-clínico. Em contraste com os seres humanos, os ratos conter três linfonodos cervicais que pesquisa linfa dos tecidos bucais da cavidade (mandibular, mandibular submandibular e parótida superficial 23). Recentemente, nós relataram o uso de HFUS para mapear a localização e morfologia desses linfonodos, monitorando mudanças no volume de linfa nó e fluxo de sangue em um modelo de rato induzida por substância cancerígena de CECP 24. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a utilização de HFUS para a identificação, de imagem e análise de nódulos linfáticos cervicais em ratos vivos. Este protocolo também demonstra a viabilidade da utilização HFUS para conduzir image- guiado biópsia por agulha fina dos linfonodos cervicais rato alargada, permitindo o monitoramento histológico de alterações no conteúdo dos linfonodos cervicais e patologias mais de time no mesmo animal. Este protocolo é facilmente adaptável para permitir o estudo detalhado da cervical patologias resultantes dos nódulos linfáticos a partir de qualquer doença invasiva cavidade oral em ratinhos.

Protocol

Todos os procedimentos com animais demonstraram neste protocolo ter sido analisado e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Universidade animal o West Virginia no âmbito de protocolos 11-0412 e 14-0514 e conduzida de acordo com os princípios e procedimentos descritos no Guia do NIH para o Cuidado e Uso dos Animais. 1. Preparação de animais Anestesiar um único rato numa câmara de indução usando 3% de isofluorano misturados com 1,5 L / min de 100% de oxigénio. Remover o animal a partir da câmara de indução e posicionar numa posição supina sobre a plataforma de imagem pré-aquecido a 40 ° C e mantida entre 37-42 ° C (Figura 2A). Confirmar anestesia pela falta de resposta a um aperto do dedo do pé. Posicione o focinho rato dentro do nosecone conectado ao sistema de anestesia. Aplicar anestesia para manutenção da sedação em estado estacionário (1,5% de isofluorano misturados com 1,5 L / min de 100% de oxigénio). Aplique lubrificante olho a cada olho para evitar morrendo prag. Aplicar gel de eléctrodo e os eléctrodos para utilizar fita adesiva para prender cada uma das quatro patas para o eléctrodo correspondente. As almofadas de eletrodo irá transmitir ECG do animal para o sistema de imagem para permitir o monitoramento da freqüência cardíaca e taxa de respiração. Lubrifique e insira a sonda de temperatura retal para o monitoramento contínuo da temperatura corporal. Temperatura normal do corpo do rato é de 36,9 ° C. 1-2 variação ° C é normal, enquanto sob anestesia. Utilizar um creme depilatório para remover o pêlo do pescoço do rato. Lavar a região do pescoço com gaze embebida em água para remover o cabelo e excesso de creme depilatório. Opcionalmente, usar a aplicação adicional de creme depilatório para remover qualquer cabelo do corpo restante (Figura 2B). 2. Identificação e aquisição de imagens de rato Cervical linfonodos Usando HFUS Para começar, aplicar uma camada de gel de ultra-som aquecida até à área do pescoço desprovida de pele. Use aplicação liberal de gel de imagem ideal paraqualidade (Figura 2C). Evitar a introdução de bolhas de ar no gel durante a aplicação, que pode interferir com a imagiologia ultra-sónica. Ajuste a plataforma de imagem 20-30 ° para que o mouse é posicionado com a cabeça ligeiramente elevada. Esta posição ajuda a assegurar a taxa de respiração óptima para o rato. Posicionar o transdutor de 40 MHz transversalmente no sistema de montagem e baixá-la cuidadosamente até que a frente do scanhead transdutor está imerso no gel de ultra-sons (Figura 2C). NOTA: Certifique-se de não colocar pressão excessiva sobre o gargalo do mouse, pois poderia causar desconforto respiratório indevida. Além disso, é útil para imagiologia por ter um tampão de gel de entre o transdutor e o rato. Imagem B-Mode e Detecção de gânglios linfáticos: Usando o computador que controla o software de aquisição HFUS, ajustar o brilho (B-) definições do modo para os seguintes parâmetros: Ganho 22 dB, profundidade 10.00mm, largura de 14,08 milímetros. NOTA: Essas configurações são um ponto de partida sugerido, e pode exigir leve ajuste para aquisição de imagem ideal entre diferentes aplicações. Observe linfonodos cervicais normais como estruturas hipoecóicas oval perto da superfície da pele dentro de um campo hiperecoica circundante. O aparecimento de nódulos linfáticos doentes podem variar entre modelos. Para sistematicamente imagem todos os gânglios linfáticos na região do pescoço use as seguintes etapas: Use o eixo Y para digitalizar o pescoço em um cranial para caudal maneira para a região torácica. Use-eixo X para centralizar a imagem. Identificar marcos principais: cavidade bucal, língua e da glândula tiróide (Figuras 3A, B e C; respectivamente); inclinar a plataforma de imagem para ajustar horizontalmente a superfície ventral do pescoço do rato, fazendo ambos os lados do pescoço até aparecer na imagem em modo B. A quantidade de inclinação depende da fisiologia de cada ratinho individual. </li> Realizar uma varredura 3D da região do pescoço toda da região bucal cavidade / língua para a glândula tireóide, a fim de mapear os gânglios linfáticos e pontos de referência associados ao longo do pescoço. Localize a região de língua / cavidade bucal (Figura 3A) e anote a localização numérica na escala Y. Localize glândula tireóide (Figura 3C) e anote a localização numérica na escala Y. Calcula-se a diferença entre os valores obtidos em (2.4.1) e (2.4.2) para determinar o comprimento total em mm para a região do pescoço com imagens. Use o botão de Y para centrar o transdutor no ponto médio do comprimento total determinado. Pressione o botão "3D". Digite o comprimento total. Para o tamanho 3D passo, utilize 0,076 milímetros para adquirir a pilha série de imagens para a região do pescoço inteiro. Quando a digitalização estiver concluída, selecione o lado direito ou esquerdo do pescoço e centrar o transdutor em um linfonodo individual de interesse, em seguida, levantar a 4Transdutor de 0 MHz fora do mouse. Retire o transdutor de 40 MHz e substituir com um transdutor de MicroScan 50 MHz (também em uma posição transversal) para obter imagens de alta resolução. Reabastecer o gel de ultra-som sobre o pescoço do mouse e diminuir o transdutor de 50 MHz para o gel de ultra-som. 3D Poder Doppler Imaging Conduta 3D varre com Doppler poder de volume de jumentos e vascularização dos linfonodos cervicais individuais do seguinte modo: Pressione o botão Power no teclado do sistema para adquirir poder Dopper e ajustar as seguintes configurações de modo de poder: PRF 4 KHz, Doppler ganhar 34 dB, 2D ganho de 30 dB, profundidade 5,00 milímetros, largura de 4,73 milímetros. NOTA: Como antes, essas configurações são um ponto de partida sugerido e podem ser modificados conforme necessário para a aquisição de imagem ideal em vários modelos. Localize a-ponto mais cranial do linfonodo de interesse e anote a localização na escala Y. Localize o ponto mais caudal do mesmo nó e notaa localização na escala Y. Calcule a diferença da distância para determinar o comprimento total do linfonodo (veja o passo 2.4.3). Centrar o transdutor no ponto médio do comprimento total determinada, usando o local Y-escala. Pressione o botão "3D" e digite comprimento total do nó de linfa. Use 0,051 milímetros para o tamanho do passo. NOTA: Devido à proximidade do transdutor para a região do tórax, o transdutor de 50 MHz podem resultar em uma imagem Doppler instável devido à detecção de movimento respiratória normal. Isto pode ser eliminado usando a opção "Respiração Gating" disponível sob a guia "fisiológica". Cerque o linfonodo selecionado com a caixa amarela que designa a região a ser analisada por power Doppler e selecione "digitalização 3D" para adquirir imagens. Elevar o transdutor fora do rato e movê-lo para o lado oposto do pescoço. Abaixe o transdutor para o mouse e repita os passos descritos acima para imalinfonodos ge deste lado do pescoço. Salvar conjuntos de imagens para análise posterior. 3. Cervical Biópsia do Linfonodo Selecione o nó de linfa desejado para biópsia e manter imaging HFUS com o transdutor de 50 MHz. Escolheu o maior linfonodo cervical visível em cada lado do pescoço mouse. Linfonodomegalias normalmente indica uma resposta inflamatória, e, portanto, estes nós são candidatos ideais para biópsia. NOTA: Nós descobrimos que é muito difícil de realizar biópsias em nódulos cervicais menor que 10 mm 3. Preparar a agulha e seringa para biópsia, colocando uma seringa de 1 ml com um anexado 27 g, 0,5 polegadas da agulha no suporte de seringa. Ajustar o suporte de agulha para orientar a agulha 90 ° em relação ao pescoço do rato (Figura 4A). Preparar por toda a plataforma de elevação rato ao nível da agulha. Conseguir isso, removendo o motor 3D e mudar para um platf mais altoorm, ou colocando um objeto sólido de altura adequada sob a plataforma curta fornecidas. Usar um suporte para tubos de microcentrífuga de plástico para esta finalidade. Se necessário, rodar a plataforma 180 °, a fim de biopsia aos nódulos localizados na parte lateral do pescoço em frente ao aparelho de agulha. Ajuste as configurações de aquisição, selecionando "Preferências", então escolhendo "Max & tampão estendida". Ampliar o campo de visão para uma profundidade de 8,00 milímetros e 9,73 milímetros de largura. Ligue o guia de agulha usando a tela de teclas de discagem. A guia de agulha irá prever o trajecto da agulha na tela e permite que o utilizador alinhe o nó de linfa de interesse no local correcto para a biópsia. Assegure-se que o nó de linfa permanece constantemente em vista centrando o nó de linfa no meio ou ligeiramente à esquerda do centro da tela (Figura 4B). Para obter toda a cine loop do procedimento, prima Pré-trigger no teclado do sistema antes de iniciar a biópsia. Ajuste o suporte da agulha até que a ponta da agulha vem na vista e contacto com a pele (Figura 4B). Avançar a agulha com um firme, rápida empurrar para perfurar a pele. Continue a avançar a agulha até que a ponta também perfura a cápsula (Figura 4C) e é visível dentro da medula (Figura 4D). Uma vez que a agulha está correctamente localizada dentro do nó, puxar suavemente o êmbolo da seringa para trás entre as demarcações 200-300 ul de realizar a biópsia (Figura 4D e 4E). Note-se que material de biópsia não é normalmente visível no interior da seringa. Remova cuidadosamente a agulha do pescoço mouse. Expelir o conteúdo da seringa para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Remover a agulha da seringa, deixando a agulha no tubo. Recolha 1 ml de mídia biópsia (a partir de uma alíquota, separados da fonte estoque) com a mesma seringa e volte a encaixar a agulha da seringa, mantendo a agulha no the tubo. Lavar a seringa e a agulha com os meios de biópsia, expulsando os meios de biópsia para dentro do tubo. NOTA: Não puxe o êmbolo enquanto a agulha está ligado em qualquer ponto após a biópsia. Isto reduz o risco de perda do material da biópsia, devido ao pequeno tamanho da amostra. Confirme linfa conteúdo do nó por meio histológicos (Figura 4F) e analisar por métodos adicionais (histoquímica, citometria de fluxo, etc.), conforme apropriado. Uma vez que a biópsia é completa, desligue a anestesia e remover a sonda de temperatura retal. Retire o excesso de gel ultra-som do mouse com gaze e remover a fita de cada pata. Remover o rato da plataforma de imagem e voltar a uma gaiola. Hemorragia mínima do local da biópsia pode ocorrer, mas este pára sem intervenção. Monitorar o mouse durante a recuperação plena atividade até que seja retomada. 4. Análise de Imagem de linfonodos cervicais <li> No software de ultra-som, selecione a imagem para análise e navegue até a guia "Processamento de Imagem". Escolha "Load em 3D". Selecione "3D Reconstruído Imagem" no canto superior esquerdo, clicar sobre o botão "Mostrar Pane Single". Use a função de zoom para ampliar a imagem, se desejar. Alternar "Layout Display" para ver a imagem apenas em B-mode, o que elimina a sobreposição de Doppler de vista. Isto faz com que seja mais fácil de ver as bordas do linfonodo durante subsequente análise 3-D. Role a série de imagens para localizar o início do nódulo linfático. Para circunscrever o linfonodo, navegue até a guia "Configurações 3D". Selecione "volume", em seguida, no botão "Iniciar" ao lado de "Parallel". Desenhe contornos ao redor da área de interesse dentro de imagens individuais através de rolagem. Continue até que as imagens que englobam todo o linfonodo estão marcados. Escolha "Concluir" paracompletar a análise. Na parte inferior da imagem, 3D% volume e vascularização será apresentada automaticamente. NOTA: 3D volume corresponde ao volume de linfonodos e por cento vascularização representa a porcentagem do linfonodo positivo para o fluxo sanguíneo pelo Doppler poder. Alternar "Layout Display" para visualizar o Doppler poder como uma sobreposição da imagem em modo B- diante. Na visão superfície observar uma vista líquida da área do volume de juros. Exportar as imagens em arquivo de imagem (TIF) ou formato 3D scans marcados como filmes (.avi) para uso posterior.

Representative Results

O esquema geral para os procedimentos de imagiologia e de biópsia é mostrado na Figura 1. As etapas importantes do processo incluem a preparação adequada do rato para a imagiologia, a identificação dos nódulos linfáticos cervicais, uma correcta preparação e realização de biópsia da agulha, e análise de B -mode e Doppler imagens para medir o volume ea quantidade de vascularização dentro de cada nó selecionado usando o software de computador. HFUS imagiologia de nódulos linfáticos cervicais rato requer a aplicação e manutenção de anestesia adequada ao longo do período de imagiologia (Figura 2A), bem como a remoção completa do cabelo que cobrem toda a área da garganta (Figura 2B). A aplicação liberal de gel de ultra-som para a região depilada garante um sinal claro HFUS durante o procedimento (Figura 2C). HFUS imagem da região do pescoço é auxiliado pela visualização de marcos anatômicos do colo do útero que produzem imagens por ultrassom característicos. Figura3 mostra exemplos dos órgãos-chave (Figura 3A-C), linfonodos cervicais em modo-B (Figura 3D) e no modo Doppler (Figura 3E). Em tempo real de imagens HFUS em ratos anestesiados permite guiar a biópsia com agulha fina de gânglios cervicais semelhantes ao que é realizado na prática clínica. A colocação da agulha de biópsia e seringa de recolha acoplado ao equipamento microinjetor controlador é mostrado na Figura 4A. B-mode subsequente imagens por ultrassom mostrar a localização ideal da agulha antes da biópsia (Figura 4B), agulha de entrada ponta em um linfonodo cervical (Figura 4C), e posição da agulha durante a biópsia (Figura 4D). Close-up imagem mostra a ponta da agulha dentro da medula do linfonodo (Figura 4E). Processamento dos componentes de biópsia por cytospin revela aglomerados de células linfóides abundantes e tecido conjuntivo associado, verificando linfonodo sucessobiópsia (Figura 4F). Análise baseada em computacional de imagens HFUS permite obter informações detalhadas a serem obtidos sobre a arquitetura do linfonodo, volume e fluxo vascular. Usando o modo Doppler poder e medições de volume 3D, cento vascularização (PV) pode ser calculado a partir de séries de imagem abrangendo nós inteiros (Figura 5A). Além disso, imagens 3D permite a reconstrução virtual de linfonodo, revelando a topografia geral dos linfonodos (Figura 5B). Figura 1:. Esquemática Visão geral dos passos envolvidos no diagnóstico HFUS linfático cervical imagiologia nó em ratinhos Os passos chave incluem 1: Preparação do ratos para imagiologia HFUS e obtenção de 40 e 50 imagens de resolução MHz da região do pescoço, contendo os nódulos linfáticos cervicais três rato . 2: biópsia por agulha fina dos linfonodos cervicais e posterior análise histológica guiada por imagem de material de biopsia. 3: análise de imagem assistida por computador e reconstrução 3D de imagens de linfonodos obtidos em modo B e Doppler para determinar o respectivo volume de linfonodo e de porcentagem (%) do fluxo vascular. Figura 2:. Resumo da alta resolução em sistema de micro-imagem in vivo para a avaliação do linfonodo cervical e biópsia (A) O sistema HFUS é mostrado com um rato anestesiado preparado para imagiologia linfonodo cervical. Também é mostrado o microinjector (MI) e fase 3D-motor (3D MS) equipamento acessório. (B) Feche acima da vista de um rato anestesiado preparado para imagens HFUS com cabelo removido na região do pescoço. (C) O mesmo do rato com o transdutor de 50 MHz no lugar no pescoço. Observe o gel de ultra-som adicional utilizado para facilitar pescoço região de imagem. 718fig3.jpg "/> Figura 3: Representante HFUS imagens anatomia do colo do útero em modo B e Doppler. (A, B) as imagens de modo B da cavidade oral, mostrando a cavidade bucal (BC) e lingueta (T) visualizada por imagem mais próximo da cavidade nasal. Os três nódulos linfáticos cervicais encontrados em cada lado do pescoço (marcado H, mandibular; SM, submandibular, SP, parótida superficial), aparecem como um grupo de estruturas hipoecoicas num plano de imagem única, como mostrado (B). (C) A glândula tiróide (Th) como visualizado na região torácica superior, aparecendo como uma estrutura em forma de borboleta sólido, ecogénico. (AC) foram visualizadas com um transdutor de 40 MHz; barra de escala = 1 mm. (D, E) Imagens representativas de normal (D) e (E) aumento dos gânglios linfáticos cervicais com B-modo e Doppler (vermelho). As linhas pontilhadas delinear linfonodos individuais. Barra de escala = 0,5 mm. <img alt="Figura 4" src = "/ files / ftp_upload / 52718 / 52718fig4.jpg" /> Figura 4: Cervical biópsia de linfonodo set-up, imagem e análise cytospin de material de biópsia (A) A plataforma de imagem que mostra a micro-injector e colocação da agulha perto do pescoço mouse.. Um suporte para tubos de microcentrífuga de largura (bloco de laranja) é usado para elevar ligeiramente a plataforma, permitindo a colocação apropriada da agulha permitindo ainda espaço para a fase de 3D-motora. Este arranjo minimiza o tempo gasto remover a fase do motor para cada rato. (B – D) Total das imagens HFUS pescoço tirada de um vídeo de uma biópsia de linfonodo cervical utilizando o transdutor de 50 MHz. Imagem em modo B HFUS mostrando a agulha posicionada para o lado do pescoço antes da biópsia (B). A ponta da agulha é a estrutura hiperecóica logo abaixo da posição da guia de agulha (linha pontilhada verde) sobreposta durante imagiologia para denotar a trajectória da agulha. O nó de linfa é no centro dea imagem. Escala da barra = 1 mm. (C) a entrada da agulha no linfonodo. (D) A biópsia do linfonodo cervical. (E) a biópsia do linfonodo Zoomed cervical. Barra de escala = 0,5 mm. Análise (F) Cytospin de material representante linfa biópsia confirmando biópsia bem sucedido. Barra de escala = 100 pm. Figura 5:. A análise por computador de imagens 3D em linfonodos cervicais (A) imagem de tela Representante de um linfonodo analisadas usando software de computador. O nó está circunscrito em azul; os resultados da análise mostram Volume 3D e vascularização por cento (PV), como indicado. Uma imagem vista superfície do mesmo nó após análise 3D (B). Processa volume inteiro do linfonodo com base em medições efectuadas em A.

Discussion

O protocolo descrito permite a visualização e avaliação in situ dos linfonodos cervicais murino usando a imagem latente HFUS não-invasivo. A utilização de modo-B e Doppler poder visualizar cervical morfologia linfonodo, volume e nó de linfa para o fluxo sanguíneo fornece uma análise experimental de sistemas de modelos pré-clínicos rato análogos àqueles utilizados para a caracterização dos gânglios cervicais de pacientes na prática clínica. A capacidade de controlar os nódulos linfáticos cervial via biópsia com agulha fina também proporciona uma técnica útil para a detecção de alterações de células imunitárias e a presença de tipos de células estranhas ou bactérias durante linfadenopatias induzida por doenças da cavidade oral, em ratos. A facilidade de utilização e de baixo custo associado com HFUS permite a avaliação rápida de estado do linfonodo cervical em uma ampla variedade de modelos animais.

Uma etapa fundamental neste protocolo é a identificação bem sucedida inicial dos gânglios linfáticos cervicais em imagens HFUS. Nossa unidade tem uma variedade de HFUS transducers como descrito, por isso, eles têm utilizado para obter as imagens da mais alta qualidade. No entanto, se os transdutores que descrevem não estão disponíveis, é possível adaptar-se a imagem utilizando outros transdutores. Para este efeito, o ajuste de profundidade e largura de imagem para obter uma imagem adequada é tudo o que é necessário. Resolução de tais imagens pode variar, mas ele ainda deve ser possível obter imagens de alta qualidade usando HFUS. Marcos de imagem da cavidade oral e da glândula tiróide vai ajudar muito em orientar o usuário para a região apropriada, onde os nódulos linfáticos são localizadas. A forma oval, natureza hypoechoic característica e localização superficial perto da superfície da pele permite a rápida identificação de confirmação dos linfonodos cervicais na região do pescoço adequada. Enquanto todas as três nós pode ser visível num plano de imagem (Figura 3B), tipicamente um ou dois nós são capturadas durante o exame. Pequenos ajustes da posição do transdutor pode ser conduzida para rasgarer diferentes planos de imagem visível, permitindo a visualização de todos os nodos de um único lado do pescoço.

Embora tenhamos encontrado a técnica descrita confiável para a identificação de linfonodos cervicais, há limitações específicas para a técnica de imagem e biópsia. A natureza superficial de rato linfonodos cervicais confere mobilidade excessiva ao mesmo ligeira pressão é aplicado à pele através da cabeça do transdutor. Isto pode ser combatido através da aplicação lentamente a cabeça de transdutor de ultra-som para o gel no pescoço do rato até que as imagens marcantes são identificados. Mobilidade linfonodo também pode complicar a biópsia por agulha fina, especialmente quando se utiliza transdutores na resolução mais alta (50 MHz) gama. Centrado imagens de nódulos linfáticos para biópsia são normalmente empurrados para fora do campo de visão, devido à força da agulha de biópsia necessária para perfurar a pele sobrejacente e cápsula. Isso pode ser remediado pelo posicionamento descentrado do linfonodo na direção da entrada da agulha,proporcionando espaço para o nó de linfa para ser empurrada através de, mas ainda permanecem dentro do campo de visão durante a biópsia. Na nossa experiência, nódulos linfáticos> 10 mm3 são muito difíceis de biópsia, e muitas vezes são empurrados pela agulha penetrou, em vez de durante o avanço da agulha. Assim, a biópsia é melhor reservado para aumento dos gânglios linfáticos, onde o tamanho é> 10 mm3 para garantir o tamanho do alvo nó e estabilidade suficientes na região cervical. Além disso, o material de biópsia não pode conter o número de células suficientes para procedimentos em que são necessárias maiores números de células (por exemplo, citometria de fluxo).

HFUS tem sido utilizado com sucesso para visualizar HNSCC ortotópico tumores 25, e tem o potencial para controlar metástases do colo do útero em ratinhos com tumores orais 24. Em adição aos ultra-sons, imagiologia bioluminescente, também tem sido usada para visualizar a formação do tumor por via oral ortotópico e cervical metástases linfáticas em ratos vivos 26,27. Como um alternabordagem operatória, imagem de bioluminescência tem uma vantagem distinta sobre HFUS em ser capaz de quantificar directamente a progressão do tumor e carga metastático ao longo do tempo no mesmo animal. Enquanto inegavelmente útil, imagem de bioluminescência é incapaz de medir muitos dos parâmetros visualizadas por HFUS, incluindo a morfologia nó de linfa, volumes nodais ou fluxo sanguíneo. Imagem de bioluminescência também requer caixas escuras especializados para manter os ratos durante o exame, tornando esta técnica inadequada para adaptação para a biópsia por agulha fina.

Além disso, a imagem de bioluminescência requer a produção de células de tumores que expressam de forma estável a enzima luciferase, permitindo esta técnica para ser utilizado apenas em casos de xenoenxertos ortotópicos com células tumorais transfectadas com luciferase em ratinhos imunocomprometidos, ou com sistemas transgénicos específicos de tecidos indutíveis que restringem a expressão de luciferase de um modo espaço-temporal específica para o tecido de origem tumoral. Em contraste, pode ser u HFUSsed em conjunto com imagens bioluminescência nestes modelos, bem como sendo capaz de imagiologia de nódulos linfáticos cervicais em modelos de tumores orais induzida por carcinogénico em ratos com sistemas imunitários completas 28,29. Enquanto HFUS pode ser mais adaptável a maioria dos modelos do rato do cancro oral, a informação combinada que pode ser obtido a partir de bioluminescência e imagem HFUS em sistemas onde as células tumorais expressam luciferase pode fornecer um quadro mais completo da cervical comprometimento dos linfonodos do que qualquer modalidade de imagem sozinha.

A capacidade de identificar e detectar nódulos linfáticos cervicais rato em tempo real permite a esta técnica para ser utilizado na maioria dos modelos de doença oral que resultam em linfadenopatia inflamatória em que o animal pode ser mantida numa posição invertida sob anestesia a curto prazo. A detecção de metástases em linfonodos ou infecção bacteriana eo impacto concomitante na morfologia do linfonodo em animais vivos apresenta um benefício significativo em relação aos métodos tradicionaisque exigem nódulos linfáticos de ser removido a partir de animais mortos para processamento histológico. Combinando HFUS com biópsia de agulha fina permite um meio para a realização de análise patológica rotina de nódulos linfáticos cervicais, semelhante ao que é realizado na clínica, proporcionar um método melhorado para monitorizar a progressão da doença na maioria dos modelos actuais de ratinho de doenças da cavidade oral.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo fundo de Dorothy D. Radford Dote da West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. O uso de modelos e de imagem West Virginia University animal Facility (AMIF) e Microscopia de imagem Facility (MIF) (apoiado pela Mary Babb Randolph Cancer Center e NIH subvenções P20 RR16440, P30 RR032138 / GM103488 e S10 RR026378) é reconhecido agradecimento.

Materials

Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada VS-11945
Power Dopper Mode and 3D Mode VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada VS-11952; VS-11484
Vevo compact anesthesia system VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada
Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada SA-11983
Thermasonic Gel Warmer VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada Optional
Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz – 55 MHz) VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada VS-11960 Referred to as 40 MHz Transducer
Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz – 70 MHz) VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada VS-12026 Referred to as 50 MHz Transducer
Ophthalmic Ointment Patterson Veterinary 07-888-1663
Electrode gel Parker Laboratories 174-1525
Tape Medical Arts Press 174-153000
Depilatory Cream Carter Products
Cotton swabs General Supply
Gauze Fisher Scientific 22-037-907
Water General Supply
Lubricating gel Parker Laboratories 57-05
Ultrasound gel Parker Laboratories 01-50
Microcentrifuge tube rack General Supply Used to raise mouse platform for optimal biopsy position
27G ½ inch needle with 1 ml syringe Fisher Scientific 14-826-87
ThinPrep PreservCyt Solution Hologic 70097-002 Refered to as biopsy media
Microcentrifuge tubes General Supply
Thinprep 2000 processor Cytyc, Marlborough, MA Blue Filter
Olympus AX70 Provis Microscope Olympus, Center Valley, PA
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Referenzen

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Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J. Vis. Exp. (101), e52718, doi:10.3791/52718 (2015).
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