DNA, Oksidasyon Biomarker HPLC ölçümü, 8-okso-7,8-dihidro-2'-deoksiganozin, Kültürlenmiş Hücrelerde ve hayvansal dokular
Summary
Bu protokolün amacı bir DNA oksidasyonu marker algılama, 8-okso-7,8-dihidro-2'-deoksiganozin kültürlenmiş hücreler ya da hayvan dokularından DNA (8-okso-dGuo) olarak hazırlanmıştır HPLC-ED ile.
Abstract
Oksidatif stres DNA dahil biomacromolecules oksidasyonu, yol, bir çok fizyolojik ve patolojik proses, hem de ksenobiyotik metabolizma ile ilişkilidir. Bu nedenle, DNA, oksidasyon etkin algılama tıp ve toksikoloji araştırması disiplinleri, çeşitli önemlidir. Oksidatif olarak hasar görmüş DNA ortak biyobelirteç 8-okso-7,8-dihidro-2'-deoksiganozin (8-okso-dGuo olduğu; genellikle hatalı olarak adlandırılır 8-hidroksi-2'-deoksiganozin (8-OH-dGuo ya da 8 -okso-dG)). Elektrokimyasal algılama (HPLC-ED), yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile 8-okso-dGuo ölçülmesi için bir çok protokol tarif edilmiştir. Bununla birlikte, bu temel pro-oksidanlar ile muamele saflaştırılmış DNA uygulanmıştır. Buna ek olarak, esas olarak analitik ekipman farklılıklara laboratuvarlar arasında metodolojik farklılıklar için, HPLC-ED 8-okso-dGuo tespiti için yayınlanan yöntemlerin benimsenmesi, her laboratuar tarafından dikkatli bir optimizasyon gerektirir. BirBöyle bir optimizasyon süreci anlatan kapsamlı protokol, eksiktir. Burada detaylı bir protokol, kültürlenmiş hücreler ya da hayvan dokularından DNA, HPLC ED ile 8-okso-dGuo tespiti için tarif edilmektedir. Bu DNA, örnek hazırlama, kolay ve hızlı bir şekilde numune hazırlama sırasında meydana gelebilecek istenmeyen bir DNA oksidasyonunu en aza indirmek için optimize edilebilir verilmektedir. Bu protokol, oksitleyici madde KBrO 3 ile muamele edilmiş kültürlenmiş insan alveolar adenokarsinoma hücreleri (örneğin, A549 hücreleri) 'de 8-okso-dGuo tespit ve polisiklik aromatik hidrokarbon dibenzo (def, s), krizen maruz kalan farelerin dalak gösterilmiştir (eski dibenzo (a, l) piren olarak bilinen DBC, DalP). Genel olarak, bu işlem, bir HPLC-ED metodolojisi kolaylıkla biyolojik örneklerde 8-okso-dGuo tespiti için optimize edilebilir verilmektedir.
Introduction
Kimin kararlı durum düzeyleri çok patolojik durumlarda ve xenotoxic metabolizma sırasında artırabilir Reaktif oksijen türleri (ROS), oksidatif DNA hasarı artan sıklığı katkıda bulunur. Birkaç olası nükleobazlar oksidasyon ürünleri arasında, oksidatif DNA hasarı hali hazırda sabit bir işaretleyici kullanılarak ölçülebilir 8-okso-7,8-dihidro-2'-deoksiganozin, 2 oksitlenmiş formlarından biridir (8-okso-dGuo), ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-okso-dGuo nedenle, birden fazla DNA oksidasyon ürünlerinin 3 varlığına rağmen, bir DNA oksidasyon biyomarker olarak daha ayrıntılı için çalışılmıştır, en bol bir DNA lezyon 2'dir ve. İnsanlarda, bu hasar 8-OxoGuanine glikozilaz 1 (hOGG1) 4 baz eksizyon tamiri üzerinden tamir edilebilir. Unrepaired bırakılırsa, 8-okso-dGuo baz çifti ikame mutasyon oluşumu (yani, G çaprazlamalar T için) katkıda bulunabilir 4. Önemli olarak, 8-okso-dGuo bir belirteçtir fo olduğubaşlatılması ve karsinogenez 2 tanıtımına ilişkin r DNA hasarı. Bu nedenle, 8-okso-dGuo doğru ölçümü oksidatif DNA hasarı 5 faydalı ve istenen biyomarkerdir.
Dahası, bileşik (ler) in doğru isim rutin oksidatif DNA hasarı 6 bir biyolojik belirteç olarak ölçülen oksidatif hasar görmüş 2-deoksiguanosin biçimleri ve doğru isimleri ile ilgili literatürde yaygın bir karışıklık vardır. 8-okso-dGuo (Şekil 1 'de gösterildiği gibi) arasında 6,8-diketo ve 6-enol, 8-keto totomerik formları, literatürde 5,7 tartışılan iki önemli tautomerleri vardır. 6,8-diketo formu 7.4, fizyolojik pH'da en önemli bir şekilde, ve en belirgin bir DNA oksidasyon ürünü 7'dir. Bu nedenle, 8-okso-dGuo yerine 8-hidroksi-dGuo Bu oksidasyon ürünü 6 için en uygun adıdır. Oldukça nucleob daha, yani 2-deoksiganozin (dGuo) dikkat etmek de önemlidirase guanin (Gua) ya da ribonükleosit guanozin (Guo), sırasıyla, çoğu yöntemlerle 6 tarafından tespit edilir.
Doğru algılama ve 8-okso-dGuo ölçümü nedeniyle zor: DNA numunesinin sindirimi i) değişkenlik, ii) tesadüfi numune hazırlama sırasında oluşabilir 8-okso-dGuo için dGuo oksidasyonu ve iii) ihtiyaç Analitik HPLC-ED yöntemi 8 etkin doğrulama için. Bu protokol, tam DNA sindirim için uygun, ve ii) dahil, metal kenetleyici ve kenetleme maddesi ile muamele edilmiş çözümler ve özel bir DNA izole reaktifi ile iii) sadece kısmen dahil edilmesi ile ele ise koşulları sağlayarak i) sağlamaya yönelik Pozitif kontrol eder ve böylece bir yöntem biyolojik örneklerde 8-okso-dGuo saptayabilen olması şartıyla. Daha fazla doğrulama bu yazının kapsamı dışındadır. Ancak, bu protokol prospektif yardımcı olacaktır eminizKullanıcıların oldukları resmen kendi amaçları bağlı protokol doğrulamak gerekir ölçüde belirler. Yöntemin resmi doğrulama için gerekli adımların bir listesini de sunulmaktadır. 8-okso-dGuo tespiti için bir yöntemin geliştirilmesi ve yerleştirilmesi sırasında, yayınlanmış yöntemler gözden geçirildi ve toplandı. Böylece, bu yöntem 8-okso-dGuo saptanması ve ölçülmesi için bir yöntem başarıyla kabul edilmiştir ise de test hızlı ve basit bir araç sunarken sık sık önemli deneysel ayrıntıları yoksun birkaç yayınlanmış kaynaklardan bilgi toplamak için gereğini ortadan kaldırır. Bu uyarlanmış yöntemi başarıyla kültüre hücreleri ve kemirgen dokudan DNA örnekleri analiz kullanılmıştır. Bu video makalede, HPLC-ED ile güvenilir algılama ve 8-okso-dGuo ölçümü için etkili bir yöntem kurulmasında diğer gruplara yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
8-okso-dGuo DNA oksidasyon yararlı bir belirteç olarak rapor edilmiş olmasına rağmen, bu güvenilir bir miktar bir sorun teşkil edebilir. Birkaç yayınlanan yöntemler bulunmasına rağmen, bunların laboratuarlarında yöntem dağıtmak için araştırmacılar izin protokol kapsamlı, açıklayıcı bakış için bir ihtiyaç vardır. Burada 8-okso-dGuo tespiti ve ölçümü için etkili bir yöntem kurmak için yeni kullanıcılar izin verir HPLC-tabanlı protokol ayrıntılı bir bakış sunuyoruz.
<p clas…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Health Canada Genomik Araştırma ve Geliştirme Girişimi (GRDI) ve Biyoteknoloji Kanada Yasal Stratejisi (CRSB) tarafından finanse edildi. Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var.
Materials
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E.coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
Referenzen
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2′ -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
- Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
- Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
- Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
- Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
- Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
- Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
- Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
- Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
- Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
- Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
- European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
- Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
- Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
- Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
- Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
- Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
- Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
- Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
- Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
- . . Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).
