该DNA氧化标志物的高效液相色谱法测量，8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷，在培养细胞和动物组织
Summary
该协议的目的是将DNA氧化标志物的检测，8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-氧dGuo）通过HPLC-ED，从培养的细胞或动物组织的DNA。
Abstract
氧化应激与许多生理和病理过程，以及生物外源性代谢相关，导致生物大分子的氧化，包括DNA。因此，高效的检测DNA氧化是多种学科的研究，包括药物和毒物的重要。氧化损伤的DNA的一个共同的生物标志物是-8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-氧代dGuo;经常误称为8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-OH-dGuo或8氧代dG的））。对于-8-氧代dGuo测量用高压液相色谱电化学检测器（HPLC-ED）几个协议已被描述。然而，这些主要适用于具有促氧化剂处理纯化DNA。此外，由于实验室之间方法上的差异，主要是由于在分析设备的差异，采用用于检测-8-氧代dGuo通过HPLC-ED公布的方法需要由每个实验室仔细优化。一个全面的协议，描述这样一个优化过程，是缺乏。这里，一个详细的协议是从培养的细胞或动物组织中所述的8-氧dGuo通过HPLC-ED的检测，在DNA中。它说明了如何DNA样品制备能够容易且快速地优化，以尽量减少可能发生的样品制备过程中不希望的DNA的氧化。这个协议显示了如何检测-8-氧代dGuo与氧化剂溴酸钾3处理培养的人肺泡腺癌细胞（ 即 ，A549细胞），以及从暴露在多环芳烃二苯并（ 闪避，p）的屈小鼠的脾脏（DBC，前身为二苯（A，L）芘，DALP）。总体来说，这一工作说明了如何用HPLC-ED方法可以用于-8-氧代dGuo生物样品中的检测可以容易地优化。
Introduction
活性氧（ROS），其稳态水平期间许多病理学病症和xenotoxic代谢能增加，有助于氧化性DNA损伤的频率增加。在几个可能的核碱基的氧化产物，氧化性DNA损伤可容易地使用稳定标记测量-8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-氧dGuo），它是2的氧化形式之一' -deoxyguanosine（dGuo）1。 -8-氧代dGuo是最丰富的DNA损伤2，因此，已研究以更详细的DNA氧化标志物尽管多种DNA氧化产物3的存在。在人类中，这种损伤可以通过碱基切除修复了8羟基鸟嘌呤糖苷酶1（hOGG1基因）4修复。如果左未修理，8-氧dGuo可以向形成的碱基对替代突变（ 即 ，G到T颠换）4。重要的是，8-氧dGuo是一个既定的标记FO- [R DNA损伤有关的启动和促进癌变2。因此，8-氧代- dGuo准确定量是氧化性DNA损伤5的有用和理想的生物标志物。
人们普遍混乱关于对氧化损伤的形式的2-脱氧鸟苷，此外，化合物（S）的正确名称常规测量作为氧化性DNA损伤6的生物标志物的正确名称的文献。的8-氧dGuo（ 图1中示出）的6,8-二酮和6-烯醇，8-酮互变异构形式都在文献5,7中讨论的两个最突出的互变异构体。的6,8-二酮的形式是在7.4的生理pH值的最突出的形式，并且是最突出的DNA氧化产物7。因此，8-氧dGuo，而不是8羟基dGuo是用于该氧化产物6的最适当的名称。同样重要的是要注意，2-脱氧鸟苷（dGuo），而不是nucleob酶鸟嘌呤（卦）或核糖鸟苷（国），分别是由大多数方法6检测。
精确检测和8-氧代dGuo量化是具有挑战性的，原因是：在该DNA样品的消化ⅰ）变异，ⅱ）dGuo的不定氧化成8-氧dGuo可能发生样品制备过程中，和iii）需要在分析HPLC-ED法8验证有效。在这个协议中，我们通过提供条件，有利的完整的DNA消化和ii）通过包含金属螯合剂和螯合剂处理的溶液和一种特殊的DNA分离试剂，而ⅲ）仅部分通过包含寻址旨在实现ⅰ）阳性对照，从而提供了该方法能够检测-8-氧代dGuo生物样品中。进一步验证超出了本文的范围。但是，我们相信，这一协议将有助于准用户确定在何种程度上他们需要正式验证协议，这取决于它们的目的。所需的方法的正式验证步骤的清单还设置。在8氧dGuo检测方法的开发和部署，公布的方法进行了回顾和巩固。因此，该方法消除了需要从几个公布来源往往缺乏重要的实验细节，同时还提供测试快速和简单的方式，如果该方法用于-8-氧代dGuo的检测和定量已成功地采用了收集信息。这种适应方法采用成功地分析DNA样本培养细胞和小鼠组织。这个视频文章将有助于其他群体建立一种有效的方法可靠的检测和8-氧dGuo定量用HPLC-ED。
Protocol
Representative Results
Discussion
虽然-8-氧代dGuo已被报告为脱氧核糖核酸氧化的有用的生物标志物，其可靠的量化可以构成挑战。虽然有几种公开的方法存在，有必要对协议的全面的，描述概述，以允许研究人员部署在他们的实验室的方法。这里，我们提出的HPLC为基础的协议，将允许新用户建立一种有效的方法-8-氧代dGuo检测和定量的详细概述。
已经描述了8个氧代dGuo量化三种主要的方法。这些包括酶联免疫…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该研究是由加拿大卫生部基因组学研究和发展倡议（GRDI）和加拿大监管策略生物技术（华润雪花）。作者有没有利益冲突。
Materials
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E.coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
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