Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.
Во время развития сердца, поколение миокарда конкретных структурных и функциональных единиц, включая саркомеров, сократительной способности мышечных волокон, внедренных в дисках, и costameres требует скоординированной сборки нескольких компонентов во времени и пространстве. Нарушение в сборе этих компонентов приводит к развития пороков сердца. Методы иммунофлуоресцентного окрашивания обычно используются в культуре кардиомиоцитов, чтобы исследовать миофибрилла созревание, но это экс естественных подход ограничен, в какой степени миоциты полностью дифференцироваться в культуре, отсутствие нормальных механических входов в естественных условиях, и отсутствие эндокардиальных сигналов. Применение методов иммунофлюоресценции для изучения развития мыши сердце является желательным, но технически более сложным, и методы часто не хватает достаточной чувствительностью и разрешением для визуализации саркомеры на ранних стадиях развития сердца. Здесь мы опишем надежный и воспроизводимый метод для совместного immunostain муltiple белки или со-визуализации флуоресцентный белок с иммунофлуоресцентного окрашивания в эмбриональном сердце мыши и использовать этот метод для анализа развивающиеся миофибриллы, интерка- диски, а costameres. Этот метод может быть дополнительно применен для оценки кардиомиоцитов структурные изменения, вызванные мутаций, которые приводят к развития пороков сердца.
Во время разработки, сердечные сокращения начнутся в ближайшее время после кардиомиоциты мигрируют к средней линии и образуют линейную 1,2 сердечной трубки. Саркомер является основной единицей сократительной в кардиомиоциты; Это очень организованная структура цитоскелета содержит нити актина с привязкой к Z-диска с помощью саркомерного α-актинина (S-α-актинина) и миозиновых волокон прикрепленных к линии М (рис 1). Как кардиомиоциты созревает, саркомеров собрать последовательно с образованием миофибрилл, которые простираются по всей клетке. Миофибриллы закреплены на концах кардиомиоцитов путем интеркалированного диска, структура узловой клетка-клетка, который содержит переходный соединение с подмножеством элементов Z-дисков, таких как ы-α-актинина 3, Адгезионные контакты белки, такие как N-кадгерина и β катенин щелевых белки, и десмосомы (Рисунок 1) 4. По продольной мембраны, Z-дисков периферических мышечных волокон такжеприложите к клеточной мембране через costameres; эти специализированные фокальные адгезии обеспечить фиксацию между миофибрилле, плазматической мембраны, и внеклеточной матрицы, чтобы обеспечить дополнительную структурную поддержку кардиомиоцитов (фиг.1) 4. В начале развития сердца, кардиомиоциты расположены в пальцеподобных прогнозов, известных как трабекулы, которые выступают в желудочковой пространстве и содержат относительно зрелые миофибриллы 5. Как развития сердца доходов, кардиомиоциты в суб-эпикардиальная области размножаться, образуя компактный миокарда, которая включает стенки желудочка, но саркомера и миофибрилла сборка задержкой по сравнению с трабекулярной миокарда 5,6.
Модели саркомера и миофибрилл сборки приходят в основном из иммунофлюоресценции на культивируемых кардиомиоцитов 7-10, которые просто, но не имеют трехмерную среду, кровоток, и контактов с другими клеток сердцаš присутствует в естественных условиях. Структурные исследования высокого разрешения с использованием иммунофлюоресценции в мышиных эмбриональных сердце являются технически сложными, и несколько исследований изучили появление вставочных дисков и costameres во время мыши развития сердца. Адгезионные контакты белок β катенином по-видимому, локализуются в интеркалированных дисков эмбриональной день (E) 17,5 11, N-кадгерин локализуется в линейных сооружений, которые могут представлять интерка- диски от E18.5 12 по сравнению с послеродовой день 0 13, и costameres были обнаружены в E18.5 14, но эти белки отображения рассеянный и более непрерывное распределение мембраны на ранних развития временных точках 11-13.
Здесь мы опишем простой и воспроизводимый метод иммунного окрашивания и флуоресцентной микроскопии разборные мышиных эмбриональных сердцах, что позволяет для детального анализа миофибриллы и развития кардиомиоцитов, в том числе появление intercalaТед диски, как уже E12.5 и зарождающихся costameres на E16.5. Этот протокол может быть полезным для исследования влияния мутаций на формирование саркомера, а также миофибрилл и кардиомиоцитов созревания.
Оптимальное методика фиксации ткани и разбавление должно быть эмпирически определено для каждого антитела. В наших руках, оснастку Замораживание превосходит PFA фиксации в течение нескольких антигенов кардиомиоцитов, в том числе с-α-актинина, β-катенина, β1-интегрина, тропомиозином, Талин (не показан) и N-кадгерина; В отличие от этого, PFA крепление дает превосходные результаты для фокальной адгезии киназы (не показан). Белковые поперечные сшивки, сформированные PFA может маскировать антигенные детерминанты и ограничить связывания антитела; Антиген поиска может потребоваться в таких случаях, и к способам извлечения антигенов можно найти в других местах 20. Концентрация PFA или длина фиксации может быть уменьшена, чтобы уменьшить эпитоп маскирование, при оптимальных условиях определены эмпирически для каждого антитела и на каждой стадии развития. Соответствующие отрицательные контроли должны использоваться при характеристике нового антитела или сердца мутант, в том числе до иммунной сывороткой в качестве контроля первичных антител и "не первичным антителом" COуправляете. Использование нокаутом мышей идеальным отрицательный контроль, но ранняя летальность предотвращает их использование для многих генных продуктов изученных здесь.
Использование адекватных объемов полностью погрузиться экспериментальной и контрольной слайдов в одной и той же блокировки иммунофлюоресценции, антитела и промывные растворы важно, как это было легкое качательное слайдов во время инкубации, чтобы обеспечить равномерное воздействие секциях к решениям. Такой подход к минимуму техническое изменчивость в окраске между разделами и слайдов в рамках эксперимента. При стоимости ограничивает объем раствора антител, использовать Pap ручку, чтобы ограничить поток решений за срезах тканей и сохранить слайды во влажной камере в течение длительного инкубации. Если Мышиные моноклональные первичные антитела – и, следовательно, анти-мыши вторичные антитела – используется, второй этап блокировки, чтобы покрыть эндогенные иммуноглобулины мыши будет необходимо (этап 3.4), чтобы уменьшить неспецифическую фоновый сигнал.
Соответствующие микроскопии и обработки изображений методы имеют решающее значение для получения биологически точную информацию 21. Гистограмма интенсивности указывает на распределение пикселей на каждом уровне интенсивности (0 – 65 535 уровней для 16-битного изображения) для каждого цвета. Фона, яркость и контрастность можно регулировать путем установки диапазона отображения интенсивности, что боковые поверхности пик гистограммы; чтобы сделать обоснованные сравнения между условиями, те же настройки между контрольной и экспериментальной условиях должны быть использованы.
Этот протокол обеспечивает надежный метод для анализа кардиомиоцитов созревание и развитие в родном эмбрионального сердца мыши. В то время как иммунофлюоресценции кардиомиоцитов-специфических белков часто используется для обозначения кардиомиоцитов в процессе разработки, несколько исследований используют методы, которые позволяют с высоким разрешением анализ миофибрилл структуры и появление вставочных дисков и costameres 12-14,22,23. Этот метод может быть использован для в vИво оценка мутаций, которые вызывают развития пороков сердца, как средство выявления изменений в кардиомиоциты созревания, которые могут пролить свет на механизмы структурных аномалий.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cryomold, Disposable Base Mold, 7×7 mm | Richard-Allen Scientific | 58949 | This size not available from Fisher Scientific |
Cryomold, Disposable Base Mold, 15×15 mm | Fisher Scientific | 22-050-159 | Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950 |
Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583 | VWR | 25608-930 | |
2-methyl butane | Sigma | M32631 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4. |
Sucrose | Sigma | S0389 | Use 15% and 30% solutions in 1X PBS. |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | "Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide. |
Acetone | Sigma | 179124 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Western Blocking Agent | Roche | 11921673001 | Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1X in PBS. |
Tween 20 | Sigma | P9416 | |
Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
Anti-s-a-actinin antibody | Sigma | A7811 | Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-bcatenin antibody | Cell Signaling | 9587s | Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400. |
Anti-b1 integrin antibody | R&D | AF2405 | Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
Anti-tropomyosin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | CH1 | Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-N-cadherin antibody | Santa Cruz | sc-7939 | Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
Anti-talin antibody | Sigma | T3287 | Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody | Invitrogen | 700255 | Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500. |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-21202 | |
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody | Life Technologies | A-11011 | |
Hoechst 33342 dye | Life Technologies | H3570 | Nuclear stain |
Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box | Keysight (formerly Agilent) | ||
Clara Interline CCD camera | Andor | ||
Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | ||
CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit | Yokogawa | ||
CFI Plan Apochromat 4X air objective | Nikon | Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm | |
CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602) | Nikon | NA 1.4, WD 0.13 mm | |
NIS Elements Imaging Software | Nikon | http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm | |
Image analysis software | Fiji | http://fiji.sc/Fiji |